Identificación y caracterización de antígenos de M. avium subsp. paratuberculosis

• Autores: Gioffré, Andrea Karina
• Año de publicación: 2007
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Romano, María Isabel
• Materia: MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP PARATUBERCULOSIS; PARATUBERCULOSIS BOVINA; ENFERMEDAD DE JOHNE; ANTIGENOS RECOMBINANTES; GENOTECA DE EXPRESION; DIAGNOSTICO; MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP.; PARATUBERCULOSIS; BOVINE PARATUBERCULOSIS; JOHNE´S DISEASE; RECOMBINANT ANTIGEN; EXPRESSION LIBRARY; DIAGNOSIS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La paratuberculosis bovina o enfermedad de Johne es una enfermedad endémica en nuestro país que afecta a los rodeos ocasionando importantes pérdidas económicas. El agente etiológico de esta enfermedad es Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Las técnicas diagnósticas actualmente disponibles no son adecuadas por la gran inespecificidad que presentan, consecuencia de las reacciones cruzadas con las micobacterias ambientales relacionadas. En este trabajo, nos propusimos la identificación y el estudio de nuevos antígenos de M. avium subsp. paratuberculosis a partir de la construcción de una genoteca de expresión en el vector λ-ZapII (Stratagene). El análisis serológico de esta genoteca, nos permitió identificar distintos antígenos candidatos, entre ellos BfrA, Hsp70, GrpE y Lpp34. Este último, representó una secuencia novedosa, específica del complejo M. avium, al cual pertenece la bacteria. La finalización de la secuenciación del genoma de esta bacteria, permitió estudiar la presencia de distintos antígenos ortólogos, descriptos con anterioridad en los integrantes del complejo M. tuberculosis: LprG y el antígeno 45/47 kDa (ModD). Adicionalmente fueron estudiadas otras proteínas como LppE y LppJ (complejo M. tuberculosis) y una proteína exclusiva de M. avium subsp. paratuberculosis, MAP860. Se expresaron las formas recombinantes de las mismas y se evaluó la respuesta humoral y celular. Se desarrolló un ELISA utilizando el antígeno recombinante ModD de MPTB. A partir de este ensayo, se pudo concluir que este antígeno constituye un buen marcador de los rodeos infectados. Este ensayo permitió detectar con la misma sensibilidad las inmunoglobulinas específicas presentes en leche. De esta manera, se puede considerar a este tipo de muestras como una alternativa al diagnóstico serológico en los tambos. Se realizó un análisis de los componentes en los Derivados Proteicos Purificados (PPDs) empleados en el diagnóstico celular de tuberculosis y paratuberculosis (PPDb y PPDa), pudiéndose caracterizar al antígeno ModD como un componente dominante en PPDa. La caracterización de la respuesta celular del antígeno Map860, exclusivo de la subespecie M. avium subp. paratuberculosis y de una PPD producida a partir de la misma micobacteria, permitió conocer la importancia de trabajar con una PPD específica y no con una derivada de una micobacteria relacionada, tal como se implementa en la actualidad. Los resultados de los estudios de la respuesta celular frente a los distintos antígenos demuestran que la elección de los candidatos adecuados podrían lograr la misma sensibilidad que el antígeno de referencia PPDa, mejorando la especificidad. Este estudio constituye la primer evaluación de antígenos recombinantes para el diagnóstico de la paratuberculosis bovina en nuestro país.
Paratuberculosis or Johne’s disease is considered an endemic ruminant illness in our country that causes important economical losses. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MPTB) is the ethiological agent. The current available techniques for the diagnosis have a low specificity, due to the presence of certain related bacteria in the environment. In the present work, we constructed and evaluated an expression library in λ-ZapII vector in order to find novel antigens from M. avium subsp. paratuberculosis. We identified distinct potential antigens, such as BfrA, Hsp70, GrpE and Lpp34. The latter antigen was identified as one exclusive for the M. avium complex. The genomic sequence from de bacterium allowed us to study the presence of the orthologous, previously evaluated for the M. tuberculosis complex: LprG ant 45/47 kDa (ModD). Additionally, we studied the antigenicity of LppE, LppJ (from M. tuberculosis complex), and MAP860, a protein specie-specific for MPTB. The recombinant proteins were expressed and the humoral, and cellular response in infected cattle were evaluated. We performed an ELISA using ModD antigen. This assay constituted a good marker for the detection of infected dairy herds and was more specific than the conventional ELISA in tuberculosis infected cattle. Milk samples were evaluated with the recombinant ELISA, allowing the detection of positive animals. Thus, this kind of samples are suitable to perform a serological screening in dairy cattle. We studied the composition of the antigenic mixtures, Purified Protein Derivative (PPDa and PPDb), conventionally used for the diagnosis of tuberculosis and paratuberculosis infected cattle. The antigen ModD is dominant in the PPDa. This work demonstrated that the appropriate combination of antigen could reach the same level of sensitivity of the reference antigen, PPDa, with an increment in the specificity. This study constitutes the first evaluation of recombinant MPTB antigens for diagnosis purposes in Argentina.
Fil: Gioffré, Andrea Karina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.