Enzimas lisosomales. Biosíntesis y translocación hacia los lisosomas : purificación de glicosiltransferasas involucradas en la dirección de enzimas lisosomales a los lisosomas

• Autores: Guillén, Eduardo Rodolfo
• Año de publicación: 1993
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Couso, Roberto Oscar
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Se conocen varios sistemas de dirección de proteínas desde su lugar de síntesis haciadonde cumplen su función. Entre los mejor estudiados está uno de los que permite que las.enzimas lisosomales neosintetizadas se dirijan a los lisosomas de las células de mamíferos. Tal como se lo conoce, este sistema de transporte se basa en cuatro componentes: a) undominio específico común en todas las enzimas lisosomales que lo emplean, b) la enzimaclave UDP — N - Acetilglucosamina : Enzima Lisosomal N — Acetilglucosamina — l — Fosfotransferasa (GlcNAc — fosfotransferasa), que reconoce específicamente este dominiocomún y transfiere GlcNAc-l-fosfato a determinadas manosas de los oligosacáridos dealta manosa de los aceptores, c) una α-N-Acetilglucosamina-l- Fosfodiester N — Acetilglucosaminidasa, que hidroliza la N—acetilglucosamina generando el marcadormanosa 6-fosfato, y d) dos receptores de manosa 6-fosfato que median el transporte de lasenzimas lisosomales hasta los lisosomas. La enzima clave es la GlcNAc-fosfotransferasa porque reconoce las enzimas lisosomalesde entre otras proteínas no lisosomales que contienen oligosacáridos similares de altamanosa. La enzima tiene un sitio catalítico que interacciona con la manosa a la quetransferirá la N-acetilglucosamina-l-fosfato, y otro sitio que reconoce específicamente undominio común a todas las enzimas lisosomales que emplean la vía de la manosa 6-fosfatopara su transporte a los lisosomas. La GlcNAc-fosfotransferasa de mamífero mejor caracterizada es la de hígado de rata, unaenzima anclada a membrana localizada en el aparato de Golgi. Cataliza la transferencia de N —acetilglucosamina —1 - fosfato desde UDP —N - acetilglucosamina a manosas alfasustituídasen el carbono anomérico. Esta GlcNAc-fosfotransferasa muestra una gran afinidad por enzimas lisosomales, con Km aparentes menores a 20 μM y eficiencias como aceptores (Vmax /Km) mayores de 160para estas proteínas, contra Km del orden milimolar y eficiencias cercanas a 1 paraglicoproteínas no lisosomales con oligosacáridos de alta manosa similares. Hasta el momento la enzima se describió con algún detalle en mamíferos y en la ameba Acanthamoeba castellanii, aunque en esta última no se han detectado los demáscomponentes del sistema de transporte a lisosomas. También se describió una GlcNAc-fosfotransferasaen Dictyostelium discoideum , pero esta, a diferencia de las anteriores, notiene la capacidad de discriminar entre enzimas lisosomales de mamífero y otrasglicoproteínas. Purificación de la GlcNAcfosfotramferasa de A. castellanii. La GlcNAc-fosfotransferasa fue purificada parcialmente a partir de membranas de Golgide hígado de rata unas 750 veces, y la de linfoblastos humanos fue purificada 3.800veces. Hasta la fecha no ha.sido posible lograr preparaciones de mayor pureza de laenzima de mamíferos, en parte debido a la dificultad en obtener cantidades suficientementegrandes de estos materiales de partida, y también por su relativamente baja actividadespecífica. En la A. castellanii la GlcNAc-fosfotransferasa tiene una actividad específica unas cienveces mayor que en mamíferos y presenta características cinéticas y de especificidad desustrato similares. Además es un microorganismo fácilmente cultivable en grandescantidades, por lo que aparece a priori como la fuente ideal para encarar la purificación deesta enzima a homogeneidad. En el presente trabajo se describe la purificación 65.000 veces de la GlcNAcfosfotransferasapresente en membranas de la ameba A. castellanii. La enzima sesolubilizó de las membranas con los detergentes Lubrol PX y desoxicolato de sodio, y sepurificó mediante cromatografías con las lectinas Concanavalina A y de Triticum vulgaris,el intercambiador iónico Q-Sepharosa, y cromatografía de exclusión molecular en Superosa 12. Las proteínas eluídas de la columna de Superosa 12 se analizaron por electroforesisdesnaturalizante en geles de poliacrilamida y se observaron solo dos bandas con un perfilde intensidades coincidente con el de la actividad enzimática. Estas proteínas tienen pesosmoleculares relativos de 71 kDa y 82 kDa. El peso molecular aparente de la GlcNAcfosfotransferasanativa estimado por filtración por gel está entre algo más de 1.000 kDa y 130 kDa según la preparación, apareciendo la mayoría de las veces como de 570 kDa. Parece probable que las proteínas de 7l y 82 kDa estén unidas en estado nativo, sea comosubunidades de una forma activa mayor, o como agregados menos definidos. Para confirmar la identificación de la GlcNAc-fosfotransfersa se obtuvieron anticuerposcontra esta enzima. Para ello se inmunizaron ratones con preparaciones de GlcNAcfosfotransferasapurificada más de 10.000 veces, produciéndose anticuerpos policlonalesespecíficos para proteínas de A. castellanií y con alta afinidad por la enzima. Tanto preparaciones crudas como altamente purificadas de GlcNAc-fosfotransferasa secromatografiaron por columnas de exlusión molecular, en las que la actividad presentóvolúmenes de elución variables que dependieron de la preparación. Las proteínas de lasfracciones eluídas se separaron por electroforesis y se efectuaron inmunoblots que serevelaron con el antisuero de ratón. Analizando las proteínas que reaccionaron con elanticuerpo y cuyo perfil de intensidades se correspondió con el de la actividad GlcNAcfosfotransferasa,se confirmó que las dos proteínas de 71 y 82 kDa son probablementesubunidades o fragmentos de subunidades de la GlcNAc-fosfotransferasa. Identificación de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en pupas de la moscamediterránea de lafruta Ceratitis capitata. Está bien establecida la existencia de lisosomas en los insectos, pero hasta ahora no sehabía descripto nada sobre el transporte de hidrolasas ácidas hacia esas organelas, ni lapresencia de enzimas de la vía metabóica de la manosa 6-fosfato. Cabe la posibilidad deque se utilize un sistema similar al que hasta ahora solo había sido encontrado en los mamíferos. Como parte del trabajo para esta tesis, se caracterizó por primera vez una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en el díptero C. capitata . Para este estudio se usó un sistema deenzayo in vitro en la búsqueda de indicios sobre el sistema de transporte de enzimaslisosomales a los lisosomas de insectos. Se ha establecido la presencia de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa asociada amembranas en pupas de seis días de la mosca mediterránea de la fruta C. capitata , capazde transferir GlcNAc-l-fosfato desde UDP-N-acetilglucosamina a a-metilmanósido. Sedemostró también que el producto es N-acetilglucosamina-(l,6)-fosfato-(α1-metilmanósido),similar al descripto para otras GlcNAc-fosfotransferasas con estesustrato. Se encontró además que las propiedades catalíticas de la GlcNAc-fosfotransfersa de C. capitata con estos sustratos. son similares a las de aquella que se encuentra en célulasde mamíferos, a la de la ameba A. castellanii y a la de D. discoídeum . La enzimapresentó in vitro un pH óptimo de 7,0; una temperatura óptima de incubación de 30 °C, yrequirió de Mn2+ o Mg2+ para su actividad. La enzima transfiere también N-acetilglucosamina-l-fosfato a manosas presentes enoligosacáridos del tipo de alta manosa, tanto de glicoproteínas endógenas como deuteroferrina, una enzima lisosomal de mamíferos. Por esta última presentó un Km ap de 63μM,similar al de la GlcNAc-fosfotransferasa de mamíferos. Al igual que esra última, semostró capaz de discriminar entre enzimas lisosomales y las que no lo son, pero queposeen oligosacáridos similares de alta manosa.
Fil: Guillén, Eduardo Rodolfo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.