Fumarasa de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae) : purificación y propiedades

• Autores: Cataldi, María Antonia
• Año de publicación: 1963
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Stoppani, Andrés Oscar Manuel
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Por método clásico de fraccionamiento de proteínas se consiguió la purificación de la enzima, fumarasa de levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae, y se realizó el estudio de algunas de sus propiedades. 1°) La levadura. libre de almidón fue sometida a un tratamiento con acetona y eter, que permeabiliza la pared celular. Obtenido el polvo acetónico la enzima se extrajo del mismo, con solución de fosfato de potasio. El extracto crudo fue clarificado por adsorción negativa en gel de fosfato, realizada "in situ" a pH 7,2. Posteriormente se fraccionó con sulfato de amonio (droga sólida). La enzima precipita con una concentración de 45-62%. El precipitado se suspendió en buffer fosfato. Para eliminar el sulfato de amonio remanente se sometió a una filtración en gel de Sephadex. Se efectuó luego la eliminación de ácido nucleicos usando sulfato de protamina. Un fraccionamiento con acetona realizado a pH 7.0 entre 44-50% de saturación del solvente, permitió aumentar la pureza de la enzima, la cual se concentró luego por liofilización. El extracto concentrado se cromatografió en columna de hidroxilapatita. La enzima fue eluída a pH 6.8 variando la fuerza iónica del buffer. Las fracciones de la columna con actividad específica máxima se juntaron y precipitaron con solución saturada de sulfato de amonio, hasta 75%. El precipitado obtenido de esta fracción contenía la enzima. Se sometió a un análisis en ultracentrífuga y se comprobó que la muestra se resolvía en un solo componente proteico. La actividad específica máxima obtenida fue 800-880 unid/mg. Los extractos crudos se purificaron entre 400-600 veces, dependiendo del grado de pureza original. 2°) La enzima fue inactivada por los reactivos de grupos sulfhidrilos, especialmente por el p-cloromercuribenzoato. Se comprobó que ensayos realizados con extractos mas purificados, requerían mayor cantidad de reactivo para la inhibición. La cisteína reactivaba la enzima inactivada. Los sustratos y el fosfato la protegían. 3°) Se determinó la constante de equilibrio en distintas condiciones. Se comprobó que la misma era afectada por la fuerza iónica del medio pero no por el pH (dentro del ámbito de pH 5.8-8.3). Se estudió la curva de pH en función de actividad para los dos sustratos y se comprobó que el pH óptimo en la reacción de deshidratación del L-malato fue 7.3 mientras que en la hidratación del fumarato, la curva presentó una meseta con valores comprendidos entre 6.0-6.5. Se probó la acción de distintos aniones sobre la actividad catalítica de la enzima. De los aniones monovalentes, el borato no influyó, el nitrato fue inhibidor, los halógenos inhibían en relación creciente a sus números atómicos y el sulfocianuro fue de los aniones inhibidores el mas potente. Los aniones bi o trivalentes ensayados, sulfato, arseniato y fosfato, resultaron ser activadores. Se estudió la influencia del fosfato en la cinética de la enzima. Se experimentó con los dos sustratos. Se comprobó que para concentraciones comprendidas entre 5-50 mM de fosfato, este activa y que a mayores concentraciones del mismo inhibe en forma competitiva. Se determinó el valor de la constante de Michaelis, en buffer Tris y se obtuvo un valor de 3.6 mM para los dos sustratos. 4°) Por estudios realizados de la variación de la constante de Michaelis con el pH, se observó que en la enzima existen grupos con una constante de ionización que puede corresponder al imidazol de la histidina.
Fil: Cataldi, María Antonia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.