La fumarasa de la levadura de panadería "Saccharomyces cerevisiae" : Obtención, purificación y propiedades

• Autores: Favelukes, Gabriel
• Año de publicación: 1957
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Stoppani, A. O. M.
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Se ha estudiado la obtención, purificación y propiedadesde la fumarasa de levadura de panadería. a) Se ha puesto a punto un método de dosaje de la actividadenzimática, independiente de toda consideración sobre la cinéticade la reacción. En él se comparan los consumos de fumarato porla muestra de enzima en un tiempo standard (medidos con el métodopermanganimétrico de Straub), con una curva patrón calibrada en unidadesenzimáticas arbitrarias. b) Se han obtenido extractos acelulares de fumarasa porautolisis en fosfato de polvo acetónico de levadura. El proceso deextracción se completa a pH 7 en 5 - 6 días, dando la enzima en formatotalmente soluble, con rendimiento y pureza comparables a los delas mejores preparaciones acelulares obtenidas por desintegración mecánica de la levadura. c) Se han ensayado diversos métodos de purificación en losextractos acelulares: la clarificación inicial con gel de fosfato dccalcio, seguida de un fraccionamiento con sulfato de amonio (0.40 — 0.60 sat.), un fraccionamiento con acetona a pH 7, y dos fraccionamientos con sulfato de amonio a pH 8 y 6, dió una preparación de una pureza 12.5 veces mayor que la inicial. d) La enzima de levadura cataliza la reacción reversiblefumarato + H2O <---> L-malatocon una constante de equilibrio Kap = (L-malato)/(fumarato) = 3.8, a pH 7 y 30°. Este valor está comprendido entre los hallados para otras fumarasas. e) La actividad sobre el fumarato en ausencia de sales esóptima a pH 6.3; la presencia de fosfatos corre este máximo al alcalino. Los cationes alcalinos y alcalinotérreos no tienen influenciaen la reacción de hidratación, los aniones arseniato, fosfato, sulfato y borato son activadores, y los cloruros, bromuros, y nitratos,son inhibidores (el fluoruro es indiferente). Los cloruros además intensifican la inactivación térmica de la enzima, que en su presenciaes protegida por el fumarato. La cinética de la reacción de hidratación en presencia de fosfato diluído demuestra un efecto activador del fumarato en concentraciones mayores de 4 mM, que no se observa en fosfato concentrado; éste también aumenta las constantes cinéticas de la reacción, y además resulta inhibidor cuando se pasa de 0.05 M a 0.1 M. Éstos resultados son semejantes a los obtenidos con la fumarasa cristalizada de corazón de cerdo, y el mecanismo desarrolladopara ésta da cuenta de aquellos hechos. f) La fumarasa de levadura se diferencia de la enzima decerdo en su inactivación rápida a pH inferiores a 6, y en su requerimiento de sulfhidrilos libres indispensables para su actividad catalítica: es inhibida por los reactivos para tioles o-iodosobenzoato; 3-melaminilfenilarsenóxido y p-cloromercuribenzoato (el más eficaz);frente al último es reactivada por la cisteína. Los sustratos y elfosfato protegen la enzima frente a los tres reactivos: con el mercurial la protección de los primeros se extiende hasta 10^(-4) M (del orden de la constante de Michaelis) en tanto que el efecto protector del fosfato es pobre. De acuerdo al modelo propuesto, el o los sulfhidrilos se hallarían en el área activa de la enzima que forma el complejo catalítico enzima-sustrato.
Fil: Favelukes, Gabriel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.