Búsqueda de marcadores pronósticos en el clon leucémico y microambiente tumoral en pacientes argentinos con leucemia linfoblástica aguda pediátrica

• Autores: Avendaño, Rodrigo Daniel
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de grado
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ruiz, María Sol
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es el cáncer con mayor incidencia en menores de 15 años y la principal causa de mortalidad en pediatría relacionada a cáncer. Si bien en los últimos años ha mejorado mucho la sobrevida de los pacientes, entre un 15-30% de los pacientes recaen. Actualmente se clasifica a los pacientes en tres grupos con distinto riesgo de progresión de la enfermedad, lo cual permite ajustar la intensidad del tratamiento. Esta estratificación se basa en factores genéticos, bioquímicos, clínicos y de respuesta temprana al tratamiento. El infiltrado inmunitario presente en el microambiente tumoral puede tanto promover como antagonizar el crecimiento tumoral. Actualmente no hay datos robustos sobre el poder pronóstico del infiltrado inmunitario en LLA; por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la composición de poblaciones del sistema inmunitario en el microambiente de la médula ósea contribuye a la variabilidad en la evolución de la enfermedad y en la respuesta clínica del paciente. Este trabajo de tesis fue realizado a partir de datos de secuenciación transcriptómica obtenidos en nuestro laboratorio a partir de muestras de médula ósea de pacientes argentinos con LLA-B al momento del diagnóstico, pertenecientes al protocolo clínico multicéntrico ALL IC-GATLA 2010 (Acute Lymphoblastic Leukemia InterContinental - Grupo Argentino de Tratamiento de la Leucemia Aguda 2010). En primer lugar, se estimó la proporción de las distintas poblaciones inmunitarias mediante citometría digital, las cuales fueron comparadas entre pacientes con distintas características clínicas. Se utilizó la herramienta de citometría digital MIXTURE, a partir de dos firmas transcripcionales (LM22 y TIL10). MIXTURE presentó una alta reproducibilidad y evidenció gran heterogeneidad en la composición de poblaciones inmunitarias entre los pacientes al momento del diagnóstico. Se observó una mayor proporción relativa de células T CD4+ (7,75% vs 3,34%, p-valor = 0,04) y una menor de monocitos (1,41% vs. 2,44%, p-valor = 0,02) en los pacientes que recayeron y/o fallecieron; mientras que los pacientes que desarrollaron toxicidad aguda relacionada al tratamiento presentaron una mayor proporción relativa de células T CD8+ (TIL10: 1,69% vs. 0,83%, p- valor = 1,00x10-6 ; LM22: 0,97% vs. 0,48%, p-valor = 0,04) y NK (1,22% vs. 0,67%, p-valor = 0,008). No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre la proporción de las distintas poblaciones y las variables clínicas adicionales evaluadas en este estudio. En segundo lugar, se estimó la abundancia de células citotóxicas mediante el cálculo de un cytolytic score a partir de los niveles de expresión de 5 genes de expresión específica en este tipo de células (NK y linfocitos T citotóxicos) (GZMA, GNLY, GZMM, PRF1, GZMH). Este índice fue estimado a partir de los datos transcriptómicos y validado por RT-qPCR, y presentó una correlación positiva significativa con la proporción de linfocitos T CD8+ , T CD4+ y células NK (Rho > 0,39; p-valor < 0,05). Se analizó mediante curvas de sobrevida la asociación entre la proporción de las poblaciones celulares o el valor del cytolytic score y el tiempo al evento muerte, recaída o muerte y/o recaída. Finalmente, mediante un análisis de todo el transcriptoma se identificó un enriquecimiento en vías biológicas relacionadas a citotoxicidad en pacientes con mayor cytolytic score, fortaleciendo la fiabilidad del índice calculado como así también un enriquecimiento en vías biológicas que podrían ser sugerentes de una alta inmunogenicidad en el microambiente tumoral de este grupo de pacientes.
Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer in children and the leading cause of cancer-related mortality in pediatric patients. Although patient survival has significantly improved in recent years, 15-30% of patients experience relapse. Currently, patients are classified into three risk groups, allowing for the adjustment of treatment intensity. This stratification is based on genetic, biochemical, clinical and early treatment response factors. The immune infiltrate present in the tumor microenvironment can either promote or antagonize tumor growth. Currently, there is limited data on the prognostic value of the immune infiltrate in ALL. Therefore, we hypothesized that the composition of immune cell populations in the bone marrow microenvironment contributes to the variability in disease progression and clinical response of patients. This thesis work was based on transcriptomic sequencing data obtained in our laboratory from bone marrow samples of B-ALL pediatric patients at the time of diagnosis, who were part of the ALL IC-GATLA 2010 (Acute Lymphoblastic Leukemia InterContinental – Grupo Argentino de Tratamiento de la Leucemia Aguda) multicentric clinical protocol in Argentina. First, the proportion of immune cell populations was estimated using digital cytometry and compared between patients with different clinical characteristics. We applied MIXTURE tool to perform digital cytometry, using two transcriptional signatures (LM22 and TIL10). MIXTURE showed high reproducibility and revealed significant heterogeneity in the composition of immune cell populations among patients at the time of diagnosis. A higher relative proportion of CD4+ T cells (7.75% vs. 3.34%, p-value=0.04) and a lower proportion of monocytes (1.41% vs. 2.44%, p-value=0.02) were observed in patients who relapsed and/or died. On the other hand, patients who developed acute treatment-related toxicity had a higher relative proportion of CD8+ T cells (TIL10: 1.69% vs. 0.83%, p-value=1.00x10-6 ; LM22: 0.97% vs. 0.48%, p-value=0.04) and NK cells (1.22% vs. 0.67%, p-value=0.008). No statistically significant differences were detected between the proportion of different cell populations and additional clinical variables evaluated in this study. Secondly, the abundance of cytotoxic cells was estimated by calculating a cytolytic score based on the expression levels of 5 genes specific to these cell type (NK cells and cytotoxic T lymphocytes) (GZMA, GNLY, GZMM, PRF1, GZMH). This index was estimated from transcriptomic data and validated by RT-qPCR, showing a significant positive correlation with the proportion of CD8+ T lymphocytes, CD4+ T lymphocytes, and NK cells (Rho>0.39; p- value<0.05). The association between the proportion of cell populations or the cytolytic score value and the time to the events (death, relapse, or death and/or relapse) was analyzed by survival curve analysis. Finally, through an analysis of the transcriptome, an enrichment in cytotoxicity-related biological pathways was identified in patients with higher cytolytic scores, further supporting the reliability of the index, as well as an enrichment in biological pathways that are suggestive of high immunogenicity in the tumor microenvironment of this group of patients.
Fil: Avendaño, Rodrigo Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.