Estudio de variantes de nucleótido único presentes en el clon leucémico en pacientes con leucemia linfoblástica aguda pediátrica

• Autores: Gomez Mercado, Ignacio Nahuel
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de grado
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ruiz, María Sol; Lacreu, María Laura
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es el cáncer con mayor incidencia en menores de 15 años y la principal causa de mortalidad en pediatría relacionada a cáncer. Si bien en los últimos años ha mejorado mucho la sobrevida de los pacientes, entre un 15-30% de los pacientes presentan recaída de la enfermedad, y los tratamientos actuales están asociados a toxicidad aguda y a largo plazo. El tratamiento actual requiere la clasificación de los pacientes en grupos de riesgo según parámetros bioquímicos, clínicos y genéticos, permitiendo ajustar el esquema terapéutico en cada grupo, tanto en intensidad como en la complementación con terapias dirigidas a blancos moleculares específicos. Tradicionalmente, los subgrupos moleculares que se identifican al diagnóstico en LLA se definen por la presencia de determinadas alteraciones cromosómicas, como genes de fusión, rearreglos cromosómicos complejos o aneuploidías. Actualmente, gracias a la aplicación de las tecnologías de secuenciación masiva en un gran número de pacientes, se han identificado más de 30 subtipos distintos de LLA, caracterizados por perfiles de expresión génica, rearreglos cromosómicos (algunos de ellos crípticos), variantes puntuales y aneuploidías. En nuestro grupo de trabajo, por primera vez en Argentina, se realizó una caracterización en profundidad del perfil molecular de las leucemias de 32 pacientes con LLA pediátrica tratados bajo el protocolo clínico nacional multicéntrico ALLIC-GATLA 2010, mediante secuenciación del transcriptoma. Este análisis permitió la identificación de subtipos moleculares, variantes de nucleótido único y transcriptos de fusión, incluyendo variantes novel cuya caracterización forma parte de este trabajo de tesis. Por otro lado, el componente inmunitario del microambiente tumoral es un factor poco explorado que podría desempeñar un papel en el establecimiento o progresión de la enfermedad, como así también modular la respuesta a quimio- e inmunoterapias. Es por esto que resulta de gran interés comprender las interacciones entre el sistema inmunitario presente en el microambiente tumoral y las células leucémicas. En nuestro grupo de trabajo hemos caracterizado dicho componente a través del análisis del transcriptoma e identificado un subgrupo de pacientes con mayor abundancia de células citotóxicas y menor sobrevida libre de eventos. En este contexto, bajo la hipótesis de que variantes genéticas presentes en el clon leucémico pueden alterar el reclutamiento y/o interacción con células del sistema inmunitario en el microambiente tumoral, en el primer objetivo específico de esta tesis se llevó a cabo una búsqueda de variantes de nucleótido único en genes de las vías de la colección Reactome asociadas con el sistema inmune, a partir de datos provenientes de la secuenciación del transcriptoma completo de muestras de aspirado de médula de 32 pacientes argentinos con LLA pediátrica al momento del diagnóstico. Se desarrolló un flujo de trabajo bioinformático para el filtrado, anotación y priorización de variantes de interés para este estudio. El análisis comparativo de muestras secuenciadas por duplicado permitió establecer un valor umbral del parámetro QUAL, obtenido a partir del llamado de variantes, para el filtrado de variantes de alta confianza, estableciendo una especificidad del 95%. Mediante esta estrategia se hallaron 11 variantes en 9 muestras, distribuidas en los genes TP53, KRAS, CEP290, UBE3B, CPNE3, DUSP4, BTN3A3, DAPP1, RNF135, TBC1D10C y TLR1. Una de las 11 variantes, presente en el gen CPNE3, resultó novel, ya que no se encontró reportada en población general ni pacientes de ninguna patología. Posteriormente, se agregó información disponible en bases de datos públicas a la caracterización de las mismas. Finalmente, se evaluó la asociación entre la presencia de las variantes en cada muestra, perfiles de expresión génica e índice citolítico como estimador de la abundancia de células citotóxicas. El segundo objetivo específico consistió en caracterizar funcionalmente variantes somáticas novel halladas previamente en nuestro grupo de investigación en muestras de LLA de pacientes argentinos. En particular se trabajó con variantes puntuales halladas en los genes CSF3R y DUX4. Para ello, se llevó a cabo la puesta a punto del clonado, mutagénesis y expresión de proteínas recombinantes, como así también una caracterización in silico de las mismas. Los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen a la caracterización de variantes somáticas presentes en leucemias pediátricas en pacientes argentinos y al desarrollo de flujos de trabajo bioinformáticos basados en transcriptómica, que pueden ser de aplicabilidad a otros modelos de tumor. El análisis en profundidad de las variantes halladas tiene el potencial de identificar mecanismos moduladores de la interacción entre el sistema inmunitario y las células leucémicas en el contexto de la LLA.
Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the cancer with the highest incidence in children under 15 years of age and the leading cause of cancer-related mortality in pediatrics. Although patient survival has greatly improved in recent years, between 15-30% of patients relapse, and current treatments are associated with acute and long-term toxicity. Current treatment requires the classification of patients into risk groups according to biochemical, clinical and genetic parameters, allowing the therapeutic scheme to be adjusted in each group, both in intensity and by combination with targeted therapies. Traditionally, the ALL molecular subgroups identified at diagnosis are defined by the presence of specific chromosomal alterations, such as fusion genes, complex chromosomal rearrangements or aneuploidies. Currently, upon the application of massive parallel sequencing technologies in a large number of patients, more than 30 different subtypes of ALL have been identified, which are characterized by gene expression profiles, chromosomal rearrangements (some of them cryptic), single nucleotide variants and aneuploidies. In our research group we performed for the first time in Argentina an in-depth characterization of the molecular profile of leukemias from 32 patients with pediatric ALL treated under the ALLIC-GATLA 2010 multicenter national clinical protocol by transcriptome sequencing. This analysis allowed the identification of molecular subtypes, single nucleotide variants and fusion transcripts, including novel variants which characterization is part of this thesis. On the other hand, the immune component of the tumor microenvironment is an under explored factor that could play a role in the establishment or progression of the disease, as well as modulate the response to chemo- and immunotherapies. Therefore, understanding the interactions between the immune system present in the tumor microenvironment and the leukemic cells is of main importance. In our group we have characterized the immune component through transcriptome analysis and identified a subgroup of patients with higher abundance of cytotoxic cells and lower event-free survival. In this context, under the hypothesis that genetic variants present in the leukemic clone may alter the recruitment and/or interaction with immune system cells in the tumor microenvironment, the first specific aim of this thesis was the identification of single nucleotide variants in genes from Reactome collections associated with the immune system, using whole transcriptome sequencing of bone marrow aspirate samples from 32 Argentine patients with pediatric ALL at the time of diagnosis. We developed a bioinformatics workflow for filtering, annotation and prioritization of variants of interest for this study. The comparative analysis of samples sequenced in duplicate allowed the establishment of a threshold value for the QUAL parameter, obtained at the variant calling step, for the selection of high-confidence variants, establishing a specificity of 95%. Using this strategy, 11 variants were found in 9 samples, in the genes TP53, KRAS, CEP290, UBE3B, CPNE3, DUSP4, BTN3A3, DAPP1, RNF135, TBC1D10C and TLR1. We found a novel variant in CPNE3, since it was not reported in general population databases or in patients with any pathology. Subsequently, variants were further annotated using publicly available information. Finally, we evaluated the association between the presence of the variants in each sample, gene expression profiles and cytolytic index as an estimator of the abundance of cytotoxic cells. The second specific aim was to perform functional assays in order to characterize novel somatic variants previously found in our research group in ALL samples from Argentine patients. In particular, we worked with single nucleotide variants found in CSF3R and DUX4 genes. For this purpose, we carried out the set-up for cloning, mutagenesis and expression of recombinant proteins, as well as an in silico characterization. The results obtained in this work contribute to the characterization of somatic variants present in pediatric leukemias in Argentine patients and to the development of bioinformatics workflows based on transcriptomics, which may be applicable to other tumor models. An in-depth analysis of the variants found in this study has the potential to identify mechanisms modulating the interaction between the immune system and leukemic cells in the context of ALL.
Fil: Gomez Mercado, Ignacio Nahuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.