Desarrollo de un ensayo competitivo para la detección de endotoxinas

• Autores: Pallarola, Diego Andrés
• Año de publicación: 2008
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Battaglini, Fernando
• Materia: LIPOPOLISACÁRIDOS; ENDOTOXINAS; CONJUGACION; FLUOROFORO; ENZIMA; ADSORCION; ENSAYO AMPEROMETRICO; ENSAYO COMPETITIVO; LIPOPOLYSACCHARIDES; ENDOTOXINS; LABELING; FLUOROPHORE; ENZYME; ADSORPTION; AMPEROMETRIC ASSAY; COMPETITIVE ASSAY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La sepsis y el shock séptico son serias causas de muerte. Estas condiciones pueden iniciarse por una liberación masiva de lipopolisacárido (LPS) proveniente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas, el cual activa en forma inapropiada el sistema inmune innato. Actualmente, el ensayo enzimático del lisado de amebocitos del Limulus Polyphemus (LAL) se utiliza ampliamente en la detección y cuantificación de endotoxinas en muestras clínicas y no clínicas. Sin embargo, este procedimiento posee varias limitaciones. El LPS está organizado en tres dominios estructurales, un heteropolisacárido que representa la superficie antigénica de la bacteria llamado antígeno O, una porción central constituido por un oligosacárido, denominado núcleo sacárido y una porción lipídica llamada lípido A, responsable de la actividad endotóxica del LPS. Debido a las propiedades químicas del LPS, el estudio de sus rutas metabólicas, su interacción con moléculas de reconocimiento o superficies modificadas, se realiza empleando LPS marcado. Por otra parte, dada su tendencia a formar agregados, su derivatización con técnicas comúnmente utilizadas en polisacáridos rinde resultados pobres y pérdida de su actividad endotóxica. En el presente trabajo de tesis se estudiaron distintas estrategias para la síntesis de conjugados de LPS de Salmonella Minnesota. La derivatización de LPS se llevó a cabo en la región polisacárida lejos del lípido A. Se han sintetizado conjugados con diversas sondas incluyendo, dansilo, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP) y complejos electroactivos. Los conjugados con biotina y HRP se utilizaron en el desarrollo de ensayos competitivos amperométricos para la detección de endotoxinas. La configuración de los ensayos involucra una superficie de oro modificada con un derivado del dextrano y como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente la región del lípido A del LPS. Para estos ensayos se ha estudiado la modificación de la superficie de oro con polímeros hidrofílicos con el objetivo de minimizar la interacción inespecífica de los componentes del ensayo con la superficie. La construcción de los electrodos se evaluó por medidas electroquímicas, elipsometría y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS). Con el sistema utilizando el conjugado de LPS-HRP se alcanzó un límite de detección de 0,06 UE mL-1.
Sepsis and septic shock are major causes of death. These conditions can be initiated by the massive release of lipopolysaccharide (LPS) from the cell wall of Gramnegative bacteria, which then inappropriately activates the innate immune system. Currently, the enzymatic Limulus Polyphemus amebocyte lysate (LAL) assay is used most widely to detect and quantify endotoxin in clinical and nonclinical samples. However, there are several limitations to this procedure. LPS is organized in three structural domains, a heteropolysaccharide which represents the antigenic surface of the bacteria called O-antigen, a short oligosaccharide, which is the core region and a fatty-acylated region called lipid A, which is the active moiety of LPS. Because of the chemical properties of LPS, studies of its biological pathways, its interactions with recognition molecules, and its interactions with modified surfaces are carried out mainly using labeled LPS. In contrast, because its ability to form aggregates, the modification of LPS using polysaccharides common labeling protocols gives poor yields and endotoxic activity loss. In this thesis work, different strategies were studied for the synthesis of Salmonella Minnesota LPS conjugates. The LPS labeling were carried out in the polysaccharide region, away from lipid A. We have synthesized conjugates with different probes including, dansyl, biotin, horseradish peroxidase (HRP) and electroactive complexes. The biotin and HRP derivatives were used in the development of competitive electrochemical assays for the detection of endotoxins. The assay configuration involves a dextran-derivative modified gold surface and a recombinant protein, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), as the recognition element, which specifically recognizes the LPS lipid A portion. For these assays, we have studied the gold surface modification with hydrophilic polymers with the objective of reducing the nonspecific interaction of the assay components with the surface. The construction of the electrodes was evaluated by electrochemical and ellipsometric measurements and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The device using the LPSHRP conjugate was able to detect the presence of endotoxins in concentrations as low as 0.06 EU mL-1.
Fil: Pallarola, Diego Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.