Detección de endotoxinas : bases para un ensayo de reconocimiento molecular

• Autores: Priano, Graciela Inés
• Año de publicación: 2006
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Battaglini, Fernando
• Materia: LPS; LIPOPOLISACARIDOS; PIROGENOS; ENDOTOXINAS; ENSAYO COMPETITIVO; ENSAYO AMPEROMETRICO; LIPOPOLYSACCHARIDES; PYROGENS; ENDOTOXINS; AMPEROMETRIC ASSAY; COMPETITIVE ASSAY; COMPETITIVE ASSAY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las endotoxinas, también conocidas como pirógenos, son constituyentes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Ellas son responsables de inducir fiebre y la disfunción progresiva de distintos órganos cuando ingresan al torrente sanguíneo. Los métodos aceptados para su detección son métodos biológicos: el ensayo LAL, basado en la gelificación del lisado de amebocitos provenientes del cangrejo herradura y el ensayo en conejos. En el presente trabajo, se estudió la interacción de las endotoxinas con una proteína de reconocimiento inmovilizada sobre dos superficies distintas con el propósito de desarrollar un ensayo competitivo amperométrico. El primer escalón en este trabajo fue realizar una detallada investigación acerca de este tipo de moléculas. Ellas son lipopolisacáridos que presentan ciertas características peculiares: la formación de agregados aún a muy bajas concentraciones, la alta variabilidad en su peso molecular y la dificultad para determinar su presencia por métodos analíticos convencionales. Fueron establecidos un método para su purificación y pautas para la manipulación y operatoria con este reactivo. Fueron estudiadas dos configuraciones de electrodos modificados utilizando como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente una porción altamente conservada de este conjunto de moléculas. La construcción de los electrodos fue seguida por técnicas electroquímicas y elipsometría, mientras que su funcionamiento fue evaluado en un ensayo competitivo, utilizando como elemento generador de la señal, un lipopolisacárido modificado con HRP. Los electrodos construidos por interacción electrostática entre ENP y un polímero electroactivo permitieron detectar la presencia de endotoxinas en concentraciones tan bajas como 0.2 EU mL^-1. Los electrodos construidos por unión covalente de ENP a una matriz de carboximetil dextran mostraron un mayor rango dinámico pero también un mayor límite de detección. Se presentó un modelo cinético para evaluar la respuesta electroquímica teniendo en cuenta los distintos métodos de inmovilización.
Endotoxins, also referred to as pyrogens, are part of the cellular walls of gram negative bacteria, and are capable of inducing fever when entering into the blood stream. Current methods of detection involve either the use of amoebocytes from horseshoe crab that clots upon exposure to endotoxin, or a live assay on rabbits. In this work the interaction of endotoxins with a recognition protein immobilized on different matrixes is studied with the aim to develop a competitive amperometric assay. The first step of this work was to understand the physicochemical characteristics of this type of molecules, which are lipopolysaccharides, since they present unique characteristics like formation of micelles, even at very low concentrations, high variability of its molecular weight, the presence of impurities and the difficult to determine its presence by analytical conventional methods. Two configurations of modified electrodes were studied using a recombinant endotoxin neutralizing protein (ENP) as recognition element. Their construction was followed by electrochemical and elipsometric techniques and tested with a modified lipopolysaccharide with horseradish peroxidase in a competitive assay. Modified electrodes constructed by electrostatic interaction of ENP and an electroactive polymer can detect the presence of endotoxins in concentrations as low as 0.2 EU mL^-1, bellow the limit imposed for water in injectable drugs in the American Pharmacopoeia. Modified electrodes constructed by covalent linking of ENP to a carboxymethyl dextran matrix bound to the electrode shows a better dynamic range but a higher detection limit. A kinetic model for the electrochemical response taking into account the different immobilization methods is presented to understand the observed results.
Fil: Priano, Graciela Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.