Desarrollo de un ensayo competitivo para la detección de endotoxinas - Pallarola, Diego Andrés (2008)
La sepsis y el shock séptico son serias causas de muerte. Estas condiciones pueden iniciarse por una liberación masiva de lipopolisacárido (LPS) proveniente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas, el cual activa en forma inapropiada el sistema inmune innato. Actualmente, el ensayo enzimático del lisado de amebocitos del Limulus Polyphemus (LAL) se utiliza ampliamente en la detección y cuantificación de endotoxinas en muestras clínicas y no clínicas. Sin embargo, este procedimiento posee varias limitaciones. El LPS está organizado en tres dominios estructurales, un heteropolisacárido que representa la superficie antigénica de la bacteria llamado antígeno O, una porción central constituido por un oligosacárido, denominado núcleo sacárido y una porción lipídica llamada lípido A, responsable de la actividad endotóxica del LPS. Debido a las propiedades químicas del LPS, el estudio de sus rutas metabólicas, su interacción con moléculas de reconocimiento o superficies modificadas, se realiza empleando LPS marcado. Por otra parte, dada su tendencia a formar agregados, su derivatización con técnicas comúnmente utilizadas en polisacáridos rinde resultados pobres y pérdida de su actividad endotóxica. En el presente trabajo de tesis se estudiaron distintas estrategias para la síntesis de conjugados de LPS de Salmonella Minnesota. La derivatización de LPS se llevó a cabo en la región polisacárida lejos del lípido A. Se han sintetizado conjugados con diversas sondas incluyendo, dansilo, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP) y complejos electroactivos. Los conjugados con biotina y HRP se utilizaron en el desarrollo de ensayos competitivos amperométricos para la detección de endotoxinas. La configuración de los ensayos involucra una superficie de oro modificada con un derivado del dextrano y como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente la región del lípido A del LPS. Para estos ensayos se ha estudiado la modificación de la superficie de oro con polímeros hidrofílicos con el objetivo de minimizar la interacción inespecífica de los componentes del ensayo con la superficie. La construcción de los electrodos se evaluó por medidas electroquímicas, elipsometría y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS). Con el sistema utilizando el conjugado de LPS-HRP se alcanzó un límite de detección de 0,06 UE mL-1.