Rol de la PKA en la regulación de la traducción en respuesta a estrés térmico en Saccharomyces cerevisiae

• Autores: Barraza, Carla Eliana
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Portela, Paula; Valacco, María Pía
• Materia: PKA; ESTRES TERMICO; RESPUESTA TRADUCCIONAL; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; GRANULOS DE ESTRES; PKA; HEAT STRESS; TRANSLATIONAL RESPONSE; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; STRESS GRANULES
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La respuesta celular a estrés incluye mecanismos como el arresto traduccional y la relocalización de mRNAs no traducidos a ribonucleopartículas, como gránulos de estrés (SGs) y cuerpos de procesamiento (PBs). La Proteína Quinasa dependiente de cAMP (PKA) participa en una amplia variedad de procesos fisiológicos. En Saccharomyces cerevisiae un único gen codifica para la subunidad regulatoria (BCY1) y tres genes para las subunidades catalíticas (TPK1, TPK2 y TPK3). Examinamos el rol de la PKA en S. cerevisiae en la respuesta a estrés térmico. Luego de someterse a estrés térmico moderado, Tpk3 se agrega y promueve la agregación de eIF4G, Pab1 y eIF4E. En cambio, el estrés térmico severo lleva a la formación de PBs y SGs que contienen tanto Tpk2 como Tpk3 y el complejo de inicio de la traducción 48S. La deleción de TPK2 lleva a un arresto traduccional robusto, un incremento en la agregación de SGs/PBs y una hipersensibilidad traduccional al estrés térmico; por otro lado, la deleción de TPK3 reprime la formación de SGs/PBs, el arresto traduccional y la respuesta de varios mRNAs analizados. Nuestras evidencias sugieren que Tpk2 y Tpk3 tendrían roles opuestos en la respuesta traduccional generada por estrés térmico y muestran cómo una misma vía de señalización puede generar respuestas fisiológicas diferentes. Analizamos complejos proteicos formados bajo estrés térmico, utilizando proteómica libre de marcación. El análisis de Gene Ontology Enrichment muestra que las proteínas enriquecidas en la fracción granular que fueron identificadas exclusivamente a 37°C, en su mayoría pertenecen a proteínas vesiculares de la familia COPI, componentes de gránulos de estrés citoplasmáticos y de subunidad ribosomal. En contraste, las proteínas enriquecidas exclusivamente en la fracción granular a 46°C 10 minutos corresponden en su mayoría a componentes de gránulos citoplasmáticos de estrés y de complejo de inicio de la traducción. Mediante microscopía de fluorescencia pudimos validar los cambios en localización sub-celular de varias proteínas candidatas obtenidas por el análisis proteómico. Para analizar la composición proteica de gránulos que contenían Tpk2 o Tpk3 evocados por estrés térmico se realizó un análisis de co-localización subcelular en colecciones de cepas que co-expresan Tpk2-mCherry o Tpk3-mCherry y ORFx-GFP. Mediante esta técnica se pudieron identificar proteínas no descritas anteriormente como componentes de gránulos evocados por estrés, y además caracterizar sus niveles de co-localización en gránulos que contienen Tpk2-mCherry o Tpk3-mCherry. En conjunto, el desarrollo de esta tesis permitió analizar cómo el estrés térmico moderado o severo genera una respuesta diferencial que se traduce en composición específica de gránulos.
Cell stress response includes mechanisms such as translational arrest and re-localization of non-translated mRNAs to ribonucleoparticles, known as stress granules (SGs) and processing bodies(PBs). Protein Kinase A (PKA) is involved in an extense variety of physiological processes. In Saccharomyces cerevisiae only one gene codifies regulatory subunit (BCY1) while three genes codify catalytic subunits (TPK1, TPK2 y TPK3). Here, we examined the role of PKA in response to heat stress in S. cerevisiae. After mild heat stress Tpk3 aggregates and promotes the aggregation of eIF4G, Pab1 and eIF4E. On the other hand, severe heat stress leads to the formation of PBs and SGs containing both Tpk2 and Tpk3 and translation initiation complex 48S. TPK2 deletion leads to a robust translational arrest, an increase in the aggregation of SGs/PBs and a translational hyper sensibility to heat stress; conversely, TPK3 deletion represses SGs/PBs formation, translational arrest and several analyzed mRNAs response. Our evidence suggests that Tpk2 and Tpk3 would have opposite roles in the translational response generated by heat stress and show how a single signaling pathway can lead to different physiological responses. We analyzed protein complexes formed under heat stress, using a label-free proteomics approach. Gene Ontology Enrichment showed that proteins enriched in the granular fraction identified exclusively at 37°C, are mostly vesicular proteins of the COPI family, granule stress components and ribosomal subunits. Differently, proteins enriched exclusively in the granular fraction at 46°C 10 minutes are mostly stress granules components and translation initiation complex proteins. Through fluorescence microscopy we were able to validate changes in localization for several candidate proteins obtained by our proteomic analysis. To evaluate protein composition of granules containing Tpk2 or Tpk3 evoked by heat stress we performed a subcellular colocalization analysis, in arrays of strains co-expressing Tpk2-mCherry or Tpk3-R and ORFx-GFP. Through these experiments we were able to identify proteins that were not described previously as granules components in response to stress conditions, and also characterize their co-localization levels with granules containing Tpk2-mCherry o Tpk3-mCherry. Altogether, the work taken in this thesis allowed us to analyze how mild or severe heat stress generates a differential response that leads to a specific granule composition.
Fil: Barraza, Carla Eliana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.