Rol de la PKA en la regulación de la traducción en respuesta a estrés térmico en Saccharomyces cerevisiae - Barraza, Carla Eliana (2020)
La respuesta celular a estrés incluye mecanismos como el arresto traduccional y la relocalización de mRNAs no traducidos a ribonucleopartículas, como gránulos de estrés (SGs) y cuerpos de procesamiento (PBs). La Proteína Quinasa dependiente de cAMP (PKA) participa en una amplia variedad de procesos fisiológicos. En Saccharomyces cerevisiae un único gen codifica para la subunidad regulatoria (BCY1) y tres genes para las subunidades catalíticas (TPK1, TPK2 y TPK3). Examinamos el rol de la PKA en S. cerevisiae en la respuesta a estrés térmico. Luego de someterse a estrés térmico moderado, Tpk3 se agrega y promueve la agregación de eIF4G, Pab1 y eIF4E. En cambio, el estrés térmico severo lleva a la formación de PBs y SGs que contienen tanto Tpk2 como Tpk3 y el complejo de inicio de la traducción 48S. La deleción de TPK2 lleva a un arresto traduccional robusto, un incremento en la agregación de SGs/PBs y una hipersensibilidad traduccional al estrés térmico; por otro lado, la deleción de TPK3 reprime la formación de SGs/PBs, el arresto traduccional y la respuesta de varios mRNAs analizados. Nuestras evidencias sugieren que Tpk2 y Tpk3 tendrían roles opuestos en la respuesta traduccional generada por estrés térmico y muestran cómo una misma vía de señalización puede generar respuestas fisiológicas diferentes. Analizamos complejos proteicos formados bajo estrés térmico, utilizando proteómica libre de marcación. El análisis de Gene Ontology Enrichment muestra que las proteínas enriquecidas en la fracción granular que fueron identificadas exclusivamente a 37°C, en su mayoría pertenecen a proteínas vesiculares de la familia COPI, componentes de gránulos de estrés citoplasmáticos y de subunidad ribosomal. En contraste, las proteínas enriquecidas exclusivamente en la fracción granular a 46°C 10 minutos corresponden en su mayoría a componentes de gránulos citoplasmáticos de estrés y de complejo de inicio de la traducción. Mediante microscopía de fluorescencia pudimos validar los cambios en localización sub-celular de varias proteínas candidatas obtenidas por el análisis proteómico. Para analizar la composición proteica de gránulos que contenían Tpk2 o Tpk3 evocados por estrés térmico se realizó un análisis de co-localización subcelular en colecciones de cepas que co-expresan Tpk2-mCherry o Tpk3-mCherry y ORFx-GFP. Mediante esta técnica se pudieron identificar proteínas no descritas anteriormente como componentes de gránulos evocados por estrés, y además caracterizar sus niveles de co-localización en gránulos que contienen Tpk2-mCherry o Tpk3-mCherry. En conjunto, el desarrollo de esta tesis permitió analizar cómo el estrés térmico moderado o severo genera una respuesta diferencial que se traduce en composición específica de gránulos.