Estrategias analíticas para estudios metabolómicos por espectrometría de masas : aplicaciones en salud y química atmosférica

• Autores: Zabalegui, Nicolás
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Monge, María Eugenia
• Materia: METABOLOMICA; ESPECTROMETRIA DE MASAS; ANALISIS DIRECTO EN TIEMPO REAL; CARCINOMA CELULAR RENAL DE CELULAS CLARAS; BIOMARCADORES; METABOLOMICS; MASS SPECTROMETRY; DIRECT ANALYSIS IN REAL TIME; CLEAR CELL RENAL CELL CARCINOMA; BIOMARKERS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La metabolómica es un campo en expansión a nivel mundial que estudia los cambios en los niveles de metabolitos en sistemas biológicos. La espectrometría de masas (MS) es una de las plataformas analíticas de preferencia para la caracterización del conjunto completo de moléculas pequeñas presentes en una muestra biológica (el metaboloma) debido a su sensibilidad y versatilidad, y ha sido aplicada a estudios metabolómicos en distintos campos, ya sea para analizar muestras de manera directa o bien acoplada a otras técnicas separativas. También se ha implementado con técnicas de desorción/ionización en condiciones ambientales. El propósito general de este trabajo de tesis es desarrollar estrategias analíticas por MS para analizar diferentes sistemas biológicos de manera de obtener paneles de metabolitos con potencial utilidad clínica en el estudio de cáncer renal o con relevancia en procesos atmosféricos. En el marco de las aplicaciones en química atmosférica, se desarrolló un método analítico utilizando la técnica de Análisis Directo en Tiempo Real (DART) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) utilizando un espectrómetro con analizador de cuadrupolo tiempo de vuelo (QTOF), para el análisis de muestras de agua marina, y se evaluó su composición en relación a la capacidad de generación de aerosoles atmosféricos. Muestras de agua de mar recolectadas en la superficie del océano o a un metro de profundidad fueron discriminadas de acuerdo a los niveles de sus compuestos orgánicos disueltos usando una estrategia de metabolómica no dirigida e implementando procedimientos de control de calidad pioneros en el campo. En relación a las aplicaciones en salud humana, se realizó una exhaustiva revisión bibliográfica de estudios metabolómicos por MS para identificar las distintas estrategias adoptadas por la comunidad científica de metabolómica para mejorar el diagnóstico de cáncer renal. A partir del estudio de modelos in vitro, se realizó un análisis del exometaboloma de dos líneas celulares tumorales de carcinoma celular renal de células claras (CCRcc) y una línea celular no tumoral mediante un método de cromatografía líquida de ultra alta performance acoplada a HRMS (UPLC-HRMS) y se logró identificar un panel de metabolitos que permitió diferenciar los sistemas estudiados. Un subgrupo de metabolitos de dicho panel, identificado con el máximo nivel de confianza empleando estándares químicos comerciales y sintetizados en el laboratorio, permitió discriminar muestras séricas de pacientes con la enfermedad de controles sanos en una cohorte piloto (n=10). En un segundo estudio, se utilizó el mismo método analítico de UPLC-HRMS para obtener los perfiles metabólicos séricos en una cohorte (n=203) de controles sanos y pacientes con CCRcc en diferentes estadios y se aislaron variables metabólicas asociadas al diagnóstico y la progresión de la enfermedad. Además, tanto por UPLC-QTOF-MS como por DART-HRMS se identificaron huellas asociadas a los cambios post-quirúrgicos que ocurren en el fenotipo de los pacientes luego de haber sido sometidos a nefrectomía, a partir de la comparación de los perfiles obtenidos en muestras pareadas con los perfiles de controles sanos. Asimismo, se desarrolló un método de análisis rápido por DART-HRMS que permitió discriminar muestras de pacientes con CCRcc de controles sanos, detectando además un sub-grupo de lípidos discriminantes asociados al pronóstico de la enfermedad. Por último, se desarrolló una metodología para evaluar muestras candidatas a materiales de referencia en estudios metabolómicos no dirigidos por UPLC-HRMS en el marco de un estudio inter-laboratorio internacional.
Metabolomics is a globally expanding field that studies changes in metabolite levels in various biological systems. Mass spectrometry is the analytical platform of preference for characterizing the small molecules present in a biological sample (the metabolome) due to its sensitivity and versatility. It has been applied to metabolomics studies in various fields, with direct sample analysis or coupled with other separation techniques, and it has also been implemented with ambient desorption/ionization techniques. The general aim of this doctoral thesis is to develop mass spectrometry-based analytical strategies to analyze different biological systems to obtain metabolite panels with potential clinical or atmospheric chemistry relevance. An analytical method was developed using Direct Analysis in Real Time (DART) coupled with high-resolution mass spectrometry (HRMS) using a quadrupole time-of-flight (QTOF) spectrometer as an approach to identifying organic molecules involved in aerosol formation processes at the air-water interface. Seawater samples, collected at the ocean surface or one-meter depth, were discriminated according to the levels of their dissolved organic compounds using an untargeted metabolomics strategy, and implementing pioneering quality control procedures in the field. Regarding applications in human health, an exhaustive literature review of mass spectrometry-based metabolomics studies was conducted to identify the different strategies adopted by the metabolomics scientific community to improve the diagnosis of renal cell carcinoma. Based on the study of in vitro models, metabolic footprints provided by conditioned media samples (n = 66) of two clear cell Renal Cell Carcinoma cell lines with different genetic backgrounds and a non-tumor renal cell line, were compared with the human serum metabolic profile of a pilot cohort (n=10), using an ultra-high performance liquid chromatography-HRMS (UPLC- HRMS)-based method. A metabolite panel allowed differentiating tumor from non-tumor cell lines and a subset of metabolites from this panel, identified with the highest level of confidence using commercial standards and standards synthesized in the laboratory, allowed discriminating serum samples from patients from healthy controls. In a second study, the same UPLC-HRMS-based analytical method was used to obtain serum metabolic profiles in a cohort (n=203) of healthy controls and ccRCC patients at different stages, and metabolic features associated with disease diagnosis and progression were isolated. In addition, signatures associated with the phenotype change after nephrectomy were identified in ccRCC patients by comparing the profiles obtained with UPLC-HRMS and DART-HRMS from paired samples. Furthermore, a fast DART-HRMS-based analysis method allowed discriminating ccRCC patients from healthy controls based on a subgroup of discriminating lipids associated with disease prognosis. Finally, a methodology was developed to evaluate reference materials in untargeted metabolomics studies by UPLC-HRMS in the context of an international inter-laboratory study.
Fil: Zabalegui, Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.