Estrategias analíticas para estudios metabolómicos por espectrometría de masas : aplicaciones en salud y química atmosférica - Zabalegui, Nicolás (2023)
La metabolómica es un campo en expansión a nivel mundial que estudia los cambios en los niveles de metabolitos en sistemas biológicos. La espectrometría de masas (MS) es una de las plataformas analíticas de preferencia para la caracterización del conjunto completo de moléculas pequeñas presentes en una muestra biológica (el metaboloma) debido a su sensibilidad y versatilidad, y ha sido aplicada a estudios metabolómicos en distintos campos, ya sea para analizar muestras de manera directa o bien acoplada a otras técnicas separativas. También se ha implementado con técnicas de desorción/ionización en condiciones ambientales. El propósito general de este trabajo de tesis es desarrollar estrategias analíticas por MS para analizar diferentes sistemas biológicos de manera de obtener paneles de metabolitos con potencial utilidad clínica en el estudio de cáncer renal o con relevancia en procesos atmosféricos. En el marco de las aplicaciones en química atmosférica, se desarrolló un método analítico utilizando la técnica de Análisis Directo en Tiempo Real (DART) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) utilizando un espectrómetro con analizador de cuadrupolo tiempo de vuelo (QTOF), para el análisis de muestras de agua marina, y se evaluó su composición en relación a la capacidad de generación de aerosoles atmosféricos. Muestras de agua de mar recolectadas en la superficie del océano o a un metro de profundidad fueron discriminadas de acuerdo a los niveles de sus compuestos orgánicos disueltos usando una estrategia de metabolómica no dirigida e implementando procedimientos de control de calidad pioneros en el campo. En relación a las aplicaciones en salud humana, se realizó una exhaustiva revisión bibliográfica de estudios metabolómicos por MS para identificar las distintas estrategias adoptadas por la comunidad científica de metabolómica para mejorar el diagnóstico de cáncer renal. A partir del estudio de modelos in vitro, se realizó un análisis del exometaboloma de dos líneas celulares tumorales de carcinoma celular renal de células claras (CCRcc) y una línea celular no tumoral mediante un método de cromatografía líquida de ultra alta performance acoplada a HRMS (UPLC-HRMS) y se logró identificar un panel de metabolitos que permitió diferenciar los sistemas estudiados. Un subgrupo de metabolitos de dicho panel, identificado con el máximo nivel de confianza empleando estándares químicos comerciales y sintetizados en el laboratorio, permitió discriminar muestras séricas de pacientes con la enfermedad de controles sanos en una cohorte piloto (n=10). En un segundo estudio, se utilizó el mismo método analítico de UPLC-HRMS para obtener los perfiles metabólicos séricos en una cohorte (n=203) de controles sanos y pacientes con CCRcc en diferentes estadios y se aislaron variables metabólicas asociadas al diagnóstico y la progresión de la enfermedad. Además, tanto por UPLC-QTOF-MS como por DART-HRMS se identificaron huellas asociadas a los cambios post-quirúrgicos que ocurren en el fenotipo de los pacientes luego de haber sido sometidos a nefrectomía, a partir de la comparación de los perfiles obtenidos en muestras pareadas con los perfiles de controles sanos. Asimismo, se desarrolló un método de análisis rápido por DART-HRMS que permitió discriminar muestras de pacientes con CCRcc de controles sanos, detectando además un sub-grupo de lípidos discriminantes asociados al pronóstico de la enfermedad. Por último, se desarrolló una metodología para evaluar muestras candidatas a materiales de referencia en estudios metabolómicos no dirigidos por UPLC-HRMS en el marco de un estudio inter-laboratorio internacional.