Papel de la estructura de la cromatina en el splicing alternativo del exón 7 del gen SMN2

• Autores: Marasco, Luciano Edmundo
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Kornblihtt, Alberto Rodolfo
• Materia: ATROFIA MUSCULAR ESPINAL; TERAPIA POR OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO; CROMATINA; TRANSCRIPCION Y SPLICING ALTERNATIVO
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad causada por deleciones o mutaciones de pérdida de función en el gen SMN1. Los humanos tenemos un gen parálogo, SMN2, que a su vez no puede compensar completamente la deficiencia en la proteína SMN porque su exón 7 (E7) es pobremente incluido en su ARN maduro. Una terapia exitosa aprobada para la AME que restaura los niveles normales de expresión de SMN consiste en la utilización de oligonucleótido antisentido (ASO), conocido como nusinersen o Nusinersen, diseñado para aumentar la inclusión del E7 en el mensajero de SMN2. Esta tesis tiene como objetivo comprender cómo la modulación de la estructura de la cromatina, así como la tasa de elongación transcripcional, afectan la inclusión del E7 de SMN2 y determinar si existen drogas que pueden afectar el splicing alternativo potenciando el efecto terapéutico de los ASO. Demostramos que la inclusión del E7 de SMN2 es sensible a los cambios en la tasa de elongación transcripcional: una transcripción lenta promueve la exclusión del E7 de SMN2, mientras que una transcripción rápida promueve su inclusión. En consecuencia, el tratamiento de células con inhibidores de desacetilasas de histonas (HDACs), como la tricostatina A (TSA) o el ácido valproico (VPA), causa un aumento en la inclusión del E7 como consecuencia de la apertura de la cromatina y el incremento en la tasa de elongación de la RNA polimerasa II (RNAPII). Además, encontramos que el tratamiento combinado de células en cultivo con HDACs y el ASO tipo Nusinersen promueve una mayor inclusión del E7 que el tratamiento con cada reactivo por separado. Estos efectos combinados se observaron no solo en las células HEK293T, sino también en fibroblastos de pacientes con AME y en el modelo de ratón transgénico de AME. El tratamiento combinado mejora la ganancia de peso, la sobrevida y la función neuromuscular de los ratones con AME. Por otra parte, la transfección de células con ASO tiene dos efectos opuestos. Por un lado, como lo mostró el laboratorio del Dr. Krainer, desplaza a los factores de splicing negativos hnRNPA1/A2 de un región silenciadora de splicing (ISS) ubicada en el intrón 7 del pre-mRNA, promoviendo en consecuencia la inclusión de E7. Por otro lado, a través de un mecanismo similar al silenciamiento génico transcripcional desencadenado por pequeños RNA de interferencia (siRNAs), el ASO promueve una mayor dimetilación de la lisina 9 de las histona H3 (H3K9me2) a lo largo del gen SMN2, una marca de histona asociada con la compactación de la cromatina y una tasa de elongación transcripcional más lenta. Los análisis mediante inmunoprecipitación de cromatina permitieron evaluar las densidades de la RNAPII y revelaron que la transfección con el ASO causa una mayor ocupación de la RNAPII alrededor de la región del gen E7 de SMN2, y que esta acumulación se revierte por completo mediante el tratamiento simultáneo de las células con inhibidores de HDACs. De esta manera, desciframos el mecanismo molecular por el cual los inhibidores de HDACs mejoran en efecto terapéutico del ASO tipo Nusinersen lo que nos permite proponer ensayos clínicos que evalúen la pertinencia de un tratamiento combinado entre Nusinersen y VPA, el inhibidor de HDACs que está autorizado para uso en humanos.
Spinal muscular atrophy (SMA) is caused by deletion or loss-of-function mutations of the SMN1 gene. Humans have a paralog gene, SMN2, that cannot fully compensate for the deficiency in the SMN protein because its exon 7 (E7) is poorly included in its mature mRNA. A successful approved therapy for SMA restores normal levels of SMN expression using an antisense oligonucleotide (ASO), known as nusinersen or Nusinersen, designed to increase E7 inclusion in the SMN2 transcript. This thesis aims at understanding how modulation of the chromatin structure, as well as the rate of transcriptional elongation, affect SMN2 E7 inclusion, and to determine whether drugs that affect chromatin- regulated alternative splicing can enhance the therapeutic effect of the ASOs. We show that SMN2 E7 inclusion is sensitive to changes in transcriptional elongation rate: slow elongation promotes SMN2 E7 skipping, while fast elongation promotes its inclusion. Accordingly, treatment of cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors, such as trichostatin A (TSA) or valproic acid (VPA), caused an increase in E7 inclusion as a consequence of chromatin relaxation and increase of RNA polymerase II (RNAPII) elongation. Furthermore, we found that the combined treatment of cells in culture with HDAC inhibitors and the Nusinersen-like ASO promotes greater inclusion of E7 than treatment with each reagent separately. These combined effects were observed not only in HEK293T cells, but also in SMA patient fibroblasts and in SMA mice, that improved weight gain, survival and neuromuscular function. Transfection of cells with the ASO has two opposite effects. On the one hand, as shown by the Krainer lab, it detaches the negative splicing factors hnRNPA1/A2 from a splicing silencer located in intron 7 of the pre-mRNA, which promotes E7 inclusion. On the other hand, through a mechanism similar to the transcriptional gene silencing triggered by small interfering RNAs (siRNAs), the ASO promotes higher H3K9 dimethylation along the SMN2 gene, a histone mark associated with chromatin compaction and slower elongation. Chromatin immunoprecipitation analyses able to assess RNAPII densities revealed that transfection with the ASO indeed causes a higher RNAPII occupancy around the SMN2 E7 gene region, and that this accumulation is fully reverted by simultaneous treatment of the cells with HDAC inhibitors. In this way, we deciphered the molecular mechanism by which HDAC inhibitors enhance the therapeutic effect of the Spinraa-like ASO and allows us to propose clinical trials to assess the pertinence of a combined treatment of Nusinersen with VPA, the HDAC inhibitor authorized for human use.
Fil: Marasco, Luciano Edmundo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.