Regulación del splicing alternativo en células neuronales y su relación con la estructura de la cromatina

• Autores: Schor, Ignacio Esteban
• Año de publicación: 2009
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Kornblihtt, Alberto Rodolfo
• Materia: SPLICING ALTERNATIVO; TRANSCRIPCIÓN; CROMATINA INTRAGENICA; ACETILACION DE HISTONAS; ACTIVIDAD NEURONAL; ALTERNATIVE SPLICING; TRANSCRIPTION; INTRAGENIC CHROMATIN; HISTONE ACETYLATION; NEURONAL ACTIVITY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Cambios en la tasa de elongación de la ARN polimerasa II (pol II) modulan los patrones de splicing alternativo, debido a que afectan el tiempo en el cual los sitios de splicing del pre- ARNm naciente son presentados a la maquinaria de splicing (un efecto conocido como acoplamiento cinético). Mostramos aquí un nuevo exón alternativo que responde a la elongación de la pol II: el exón 18 de la molécula de adhesión celular neural (NCAM), cuya inclusión es regulada durante la diferenciación y la plasticidad sináptica. Buscando estímulos que afecten al splicing alternativo a través de su acoplamiento cinético con la transcripción, encontramos que la despolarización del potencial de membrana de células neuronales provoca la exclusión del exón 18 del ARNm maduro. El efecto se observa tanto en cultivos primarios de neuronas hipocampales como en una línea de neuroblastoma murino, y es independiente de la vía de las kinasas dependientes de calcio/calmodulina (CaMKs). Un análisis de los niveles de modificaciones de histonas a lo largo del locus endógeno de Ncam revela una disminución local de marcas asociadas a transcripción activa y elongación de la pol I I, como tri-metilación de H3K36 y acetilación de histonas, en la vecindad del exón 18. El tratamiento de despolarización afecta la cromatina de este gen en forma específica, causando un incremento en acetilación de H3K9 en una región interna que incluye a este exón alternativo. Esta acetilación intragénica está asociada a mayor apertura de la cromatina, mayor procesividad de la pol II y tri-metilación de H3K36 en esta región, pero no es acompañada por cambios en el promotor del gen. En base a los resultados de la tesis presentamos un modelo donde la excitación neuronal dispara cambios en la estructura de la cromatina intragénica del gen de NCAM, que facilita la elongación de la pol II en esta región y subsecuentemente causa la exclusión del exón 18 del ARNm. Este modelo señala un rol fisiológico de la modulación de la cromatina intragénica en la biogénesis de los ARNm en las células eucariotas.
Changes in RNA polymerase II (pol II) elongation rates modulate alternative splicing choices, affecting the timing at which nascent pre-mRNA splice sites and regulatory sequences are presented to the spliceosome (an effect known as kinetic coupling). We show here a new case of an alternative exon that responds to pol II elongation: the exon 18 from the neural cell adhesion molecule (NCAM), whose inclusion is modulated during differentiation and synaptic plasticity. In search for physiological pathways affecting alternative splicing through its kinetic coupling with transcription, we found that membrane depolarization of neuronal cells triggers the skipping of exon 18 from mature mRNA. The effect is seen in both primary cultured neurons and N2a murine neuroblastoma cells, and is independent of the calcium/calmodulin protein kinase (CaMK) pathway. Analysis of histone modifications across the endogenous Ncam locus revealed a local decrease in marks of transcriptional elongation and active transcription, such as H3K36 tri-methylation and histone acetylation, in the neighbourhood of exon 18. Depolarization affects the chromatin template in a specific way, by causing an increase in H3K9 acetylation on an internal region of the NCAM gene surrounding the alternative exon. This intragenic histone hyperacetylation is associated with chromatin relaxation, increased pol II processivity and is linked to H3K36 tri-methylation, but is not paralleled by changes at the promoter,. The effects on acetylation and splicing are reverted when the depolarizing conditions are withdrawn and can be both duplicated and potentiated by the histone deacetylase inhibitor trichostatin A. Based on these evidences, we present a model where neuronal excitation acts by promoting changes in the intragenic chromatin structure of the NCAM gene, which allows higher pol II elongation rates and the subsequent skipping of exon 18. This model points at a physiological role of intragenic chromatin modulation in eukaryotic mRNA biogenesis.
Fil: Schor, Ignacio Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.