Papel de la estructura de la cromatina en el splicing alternativo del exón 7 del gen SMN2 - Marasco, Luciano Edmundo (2022)
La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad causada por deleciones o mutaciones de pérdida de función en el gen SMN1. Los humanos tenemos un gen parálogo, SMN2, que a su vez no puede compensar completamente la deficiencia en la proteína SMN porque su exón 7 (E7) es pobremente incluido en su ARN maduro. Una terapia exitosa aprobada para la AME que restaura los niveles normales de expresión de SMN consiste en la utilización de oligonucleótido antisentido (ASO), conocido como nusinersen o Nusinersen, diseñado para aumentar la inclusión del E7 en el mensajero de SMN2. Esta tesis tiene como objetivo comprender cómo la modulación de la estructura de la cromatina, así como la tasa de elongación transcripcional, afectan la inclusión del E7 de SMN2 y determinar si existen drogas que pueden afectar el splicing alternativo potenciando el efecto terapéutico de los ASO. Demostramos que la inclusión del E7 de SMN2 es sensible a los cambios en la tasa de elongación transcripcional: una transcripción lenta promueve la exclusión del E7 de SMN2, mientras que una transcripción rápida promueve su inclusión. En consecuencia, el tratamiento de células con inhibidores de desacetilasas de histonas (HDACs), como la tricostatina A (TSA) o el ácido valproico (VPA), causa un aumento en la inclusión del E7 como consecuencia de la apertura de la cromatina y el incremento en la tasa de elongación de la RNA polimerasa II (RNAPII). Además, encontramos que el tratamiento combinado de células en cultivo con HDACs y el ASO tipo Nusinersen promueve una mayor inclusión del E7 que el tratamiento con cada reactivo por separado. Estos efectos combinados se observaron no solo en las células HEK293T, sino también en fibroblastos de pacientes con AME y en el modelo de ratón transgénico de AME. El tratamiento combinado mejora la ganancia de peso, la sobrevida y la función neuromuscular de los ratones con AME. Por otra parte, la transfección de células con ASO tiene dos efectos opuestos. Por un lado, como lo mostró el laboratorio del Dr. Krainer, desplaza a los factores de splicing negativos hnRNPA1/A2 de un región silenciadora de splicing (ISS) ubicada en el intrón 7 del pre-mRNA, promoviendo en consecuencia la inclusión de E7. Por otro lado, a través de un mecanismo similar al silenciamiento génico transcripcional desencadenado por pequeños RNA de interferencia (siRNAs), el ASO promueve una mayor dimetilación de la lisina 9 de las histona H3 (H3K9me2) a lo largo del gen SMN2, una marca de histona asociada con la compactación de la cromatina y una tasa de elongación transcripcional más lenta. Los análisis mediante inmunoprecipitación de cromatina permitieron evaluar las densidades de la RNAPII y revelaron que la transfección con el ASO causa una mayor ocupación de la RNAPII alrededor de la región del gen E7 de SMN2, y que esta acumulación se revierte por completo mediante el tratamiento simultáneo de las células con inhibidores de HDACs. De esta manera, desciframos el mecanismo molecular por el cual los inhibidores de HDACs mejoran en efecto terapéutico del ASO tipo Nusinersen lo que nos permite proponer ensayos clínicos que evalúen la pertinencia de un tratamiento combinado entre Nusinersen y VPA, el inhibidor de HDACs que está autorizado para uso en humanos.