Caracterización funcional de las proteínas de la familia ''CRISP'' a través del modelo de animales knock out : desde el epidídimo a la fertilidad masculina

• Autores: Carvajal, Guillermo
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Cuasnicú, Patricia Sara
• Materia: ESPERMATOZOIDE; FERTILIDAD; FERTILIZACION; CRISP; KNOCKOUT; EPIDIDIMO; SPERM; FERTILITY; FERTILIZATION; CRISP; KNOCKOUT; EPIDIDYMIS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las proteínas CRISP (Cysteine-Rich Secretory Proteins) se expresan principalmente en el tracto reproductor masculino de mamíferos y actúan como mediadores del proceso de fertilización. Dos de los cuatro miembros descriptos de la familia, CRISP1 y CRISP4, se expresan en el epidídimo y se asocian al espermatozoide durante la maduración epididimaria. Dado que los ratones knockout (KO) para cada una estas proteínas resultaron fértiles sugiriendo la existencia de mecanismos de compensación, el objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar la relevancia de las proteínas CRISP para la fertilidad a través del empleo de animales deficientes en las dos proteínas epididimarias simultáneamente. Contando con una colonia de animales KO para CRISP1, en primer lugar, se generó y caracterizó una colonia deficiente en CRISP4 no disponible en el laboratorio. Los resultados mostraron que, si bien los machos KO no mostraban defectos en su fertilidad ni en los niveles de fertilización in vivo, exhibían claras deficiencias en su capacidad de fertilizar al ovocito in vitro. Asimismo, los espermatozoides KO presentaron alteraciones en su potencial de membrana, en los niveles de calcio y en distintos parámetros asociados a la capacitación espermática, apoyando la importancia de CRISP4 para el correcto funcionamiento del espermatozoide. Una vez establecida y caracterizada la colonia KO para CRISP4, se generaron animales doble KO (DKO) para CRISP1 y CRISP4 por apareo entre las colonias KO individuales. Nuestras observaciones mostraron que la falta simultánea de las dos proteínas epididimarias produjo claros defectos en la fertilidad masculina, confirmando la relevancia de las proteínas CRISP para la fertilidad del individuo como así también la existencia de una compensación funcional entre proteínas de la familia. Los espermatozoides de animales DKO mostraron un mayor número de defectos re specto a los animales simple KO tanto a nivel de su maduración epididimaria como de su habilidad para capacitarse e interactuar con el ovocito. Mientras que la mayoría de los animales DKO exhibieron solo defectos específicos en la capacidad fertilizante de sus espermatozoides, un tercio de los mismos mostró un inesperado fenotipo de epidídimo-orquitis, con niveles alterados de moléculas inflamatorias y espermatozoides no viables en el epidídimo. Diferentes estudios realizados con el fin de esclarecer el origen de los fenotipos observados mostraron que los ratones DKO exhibían claros defectos en la diferenciación del epitelio epididimario y acidificación luminar que resultaron más severos en los animales con fenotipo inflamatorio, apoyando a estos defectos como posibles responsables de los diferentes fenotipos observados. Experimentos realizados con células en cultivo demostraron que CRISP1 es capaz de modular vías de señalización en las células principales, sugiriendo que este sea el mecanismo por el cual las CRISP actúan sobre el epitelio. En conjunto, estas observaciones indican la relevancia de las proteínas CRISP para el funcionamiento del epidídimo y fertilidad masculina, contribuyendo a una mejor comprensión de los mecanismos involucrados tanto en la maduración espermática como en la característica inmunotolerancia del epidídimo, con claras implicancias para la fisiología y patología epididimaria humana.
Cysteine-Rich Secretory Proteins are expressed mainly in the mammalian male reproductive tract and are key mediators of the fertilization process. Two of the four described family member, CRISP1 and CRISP4, are expressed by the epididymis and associate with the sperm during epididymal maturation. As individual knockout (KO) mice for these proteins are fertile, suggesting the existence of compensatory mechanisms, the aim of the present Doctoral Thesis has been to study the relevance of CRISP proteins for fertility using animals deficient in the two epididymal proteins simultaneously. Having a CRISP1 KO colony, we first generated and characterized a CRISP4 deficient colony not available at our laboratory. Our results showed that although males lacking CRISP4 showed no defects in their fertility or in vivo fertilization, they exhibited clear deficiencies in their ability to fertilize oocytes in vitro. Moreover, KO spermatozoa presented alterations in its membrane potential and calcium levels together with deficiencies in different parameters associated with sperm capacitation, supporting the importance of this protein for correct sperm function. Having an established and characterized CRISP4 KO colony, double knockout (DKO) animals for CRISP1 and CRISP4 were generated by mating animals from the individual KO colonies. Our observations showed that the simultaneous lack of the two epididymal proteins results in clear defects in male fertility, confirming the relevance of these proteins for animal fertility and the existence of a functional compensation between CRISP family proteins. DKO sperm showed more defects than the single KO at epididymal maturation level as well as deficiencies in their ability to undergo capacitation and interact with the oocyte. Whereas most of the animals only exhibited specific sperm fertilizing ability defects, one third of the males showed an unexpected epididymo-orchitis phenotype with altered levels of inflammatory molecules and non-viable sperm in the epididymis. Different studies carried out in order to clarify the origin of the observed phenotypes showed that DKO mice exhibited defects in epididymal epithelium differentiation and luminal acidification which were more severe in those males with inflammation, supporting these defects as likely responsible for the different phenotypes observed. Experiments carried out with cells in culture showed that CRISP1 can modulate signaling pathways in the principal cells, suggesting that this would be the mechanism of action for CRISP on the epithelium. Together, these observations reveal the relevance of CRISP proteins for epididymal function and male fertility, contributing to a better understanding of the mechanisms underlying sperm maturation and immunotolerance in the epididymis with clear implications for human epididymal physiology and pathology.
Fil: Carvajal, Guillermo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.