Relevancia de las proteínas de la familia CRISP para la fertilidad : estudios sobre modelos de animales ''knockout''

• Autores: Brukman, Nicolás Gastón
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Cuasnicú, Patricia Sara; Da Ros, Vanina G.
• Materia: ESPERMATOZOIDE; FERTILIDAD; FERTILIZACION; CAPACITACION; CRISP; KNOCKOUT; SPERM; FERTILITY; FERTILIZATION; CAPACITATION; CRISP; KNOCKOUT
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las proteínas CRISP1-4 (Cysteine-Rich Secretory Proteins) se expresan en el tracto reproductor masculino de mamíferos y participan en el proceso de fertilización. El objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar la relevancia de las mismas para la fertilidad. En primer lugar, sabiendo que la proteína espermática CRISP2 participa en el proceso de fusión de gametas, nos propusimos estudiar su relevancia para la fertilidad a través del empleo de animales knockout (KO). Si bien los machos KO resultaron fértiles, los mismos exhibían deficiencias en la fertilización in vivo. Asimismo, estudios de fertilización in vitro revelaron que los espermatozoides KO presentaban defectos en su capacidad para penetrar las envolturas del ovocito y fusionarse con el mismo. Consistentemente, estos espermatozoides mostraban menores niveles de hiperactividad así como un aumento exacerbado de los niveles de Ca2+ intracelular durante la capacitación. En conjunto, estos resultados apoyan la relevancia de CRISP2 no solo para la fertilización sino también para la fertilidad de un individuo. Por otro lado, teniendo en cuenta que se han encontrado menores niveles de CRISP2 en pacientes infértiles con problemas en la motilidad espermática, el segundo objetivo consistió en estudiar si dichos defectos en la motilidad están asociados a una desregulación del Ca2+. Apoyando los resultados correspondientes al primer objetivo, observamos una asociación negativa entre la expresión de CRISP2 y el aumento de Ca2+ intracelular que ocurre durante la capacitación, indicando que CRISP2 cumpliría un rol en la regulación de Ca2+ en el espermatozoide humano. Asimismo, observamos que la entrada de Ca2+ que ocurre a través de CatSper podía prevenirse inhibiendo la fosforilación de proteínas en tirosina que se observa durante la capacitación, sugiriendo que la modulación de esta vía podría utilizarse como estrategia terapéutica en espermatozoides con niveles alterados de Ca2+. Finalmente, teniendo en cuenta la alta similitud de secuencia y la redundancia funcional entre las proteínas CRISP, como tercer objetivo evaluamos el fenotipo reproductivo de animales deficientes en más de una proteína CRISP simultáneamente. Si bien la fertilidad de los animales doble KO para Crisp2 y Crisp4 fue normal, los ratones deficientes en tres o en las cuatro proteínas CRISP presentaron severos defectos de fertilidad asociados a fallas en la fertilización observadas tanto in vivo como in vitro, confirmando no solo la relevancia de estas proteínas para la fertilidad sino también la existencia de mecanismos de cooperación funcional entre miembros de la familia. En conjunto, estos estudios contribuirán a una mejor comprensión de los mecanismos involucrados en el proceso de fertilización contribuyendo al desarrollo de mejores métodos de diagnóstico y tratamiento de la infertilidad así como de regulación de la fertilidad.
The Cysteine-Rich Secretory Proteins (CRISP1-4) are expressed in the mammalian male reproductive tract and participate in the fertilization process. The main aim of this Thesis has been to study the relevance of CRISP proteins for fertility. In first place, based on the proposed role of the sperm protein CRISP2 in gamete fusion in both rodents and humans, and the evidence in humans showing that aberrant expression of this protein is associated with male infertility, we evaluated the relevance of CRISP2 for fertility by studying the phenotype of Crisp2 knockout (KO) mice. Our results showed that while mutant males presented normal fertility, they exhibited clear defects in in vivo fertilization. In addition, in vitro fertilization studies revealed that CRISP2-deficient sperm exhibited deficiencies to penetrate the egg vestments and to fuse with the egg. Consistent with this, KO sperm showed lower levels of hyperactivation as well as an exacerbated increase in intracellular Ca2+ levels during capacitation. Together, these results support the relevance of CRISP2 for both fertilization and fertility. Secondly, considering that lower levels of CRISP2 were detected in infertile patients with sperm motility problems, the second objective of this work was to investigate if those motility defects could be associated with a dysregulation in intracellular Ca2+ levels. Supporting our previous results, we observed a negative correlation between the intracellular Ca2+ increase during capacitation and CRISP2 expression, suggesting that, as in rodents, CRISP2 plays a role in the regulation of Ca2+ in human sperm. Moreover, we observed that Ca2+ entry through CatSper could be prevented by inhibiting the proteins tyrosine phosphorylation that occurs during capacitation, suggesting that the modulation of this signaling cascade could be used as a therapeutic strategy in sperm with altered levels of Ca2+. Finally, taking into account the high sequence similarity and the functional redundancy between the CRISP proteins, we next evaluated the reproductive phenotype of mice lacking more than one CRISP protein simultaneously. Although the fertility of Crisp2 and Crisp4 double KO mice was normal, the animals lacking three or the four CRISP proteins exhibited severe defects in their fertility associated with deficiencies in in vivo and in vitro fertilization, confirming not only the relevance of these proteins for fertility but also the existence of a functional cooperation among CRISP family members. Altogether, we consider that these studies will contribute to a better understanding of the molecular mechanisms underlying the fertilization process, as well as to the development of new methods of diagnosis and treatment of infertility and fertility regulation.
Fil: Brukman, Nicolás Gastón. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.