Caracterización funcional de las proteínas de la familia ''CRISP'' a través del modelo de animales knock out : desde el epidídimo a la fertilidad masculina - Carvajal, Guillermo (2019)
Las proteínas CRISP (Cysteine-Rich Secretory Proteins) se expresan principalmente en el tracto reproductor masculino de mamíferos y actúan como mediadores del proceso de fertilización. Dos de los cuatro miembros descriptos de la familia, CRISP1 y CRISP4, se expresan en el epidídimo y se asocian al espermatozoide durante la maduración epididimaria. Dado que los ratones knockout (KO) para cada una estas proteínas resultaron fértiles sugiriendo la existencia de mecanismos de compensación, el objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar la relevancia de las proteínas CRISP para la fertilidad a través del empleo de animales deficientes en las dos proteínas epididimarias simultáneamente. Contando con una colonia de animales KO para CRISP1, en primer lugar, se generó y caracterizó una colonia deficiente en CRISP4 no disponible en el laboratorio. Los resultados mostraron que, si bien los machos KO no mostraban defectos en su fertilidad ni en los niveles de fertilización in vivo, exhibían claras deficiencias en su capacidad de fertilizar al ovocito in vitro. Asimismo, los espermatozoides KO presentaron alteraciones en su potencial de membrana, en los niveles de calcio y en distintos parámetros asociados a la capacitación espermática, apoyando la importancia de CRISP4 para el correcto funcionamiento del espermatozoide. Una vez establecida y caracterizada la colonia KO para CRISP4, se generaron animales doble KO (DKO) para CRISP1 y CRISP4 por apareo entre las colonias KO individuales. Nuestras observaciones mostraron que la falta simultánea de las dos proteínas epididimarias produjo claros defectos en la fertilidad masculina, confirmando la relevancia de las proteínas CRISP para la fertilidad del individuo como así también la existencia de una compensación funcional entre proteínas de la familia. Los espermatozoides de animales DKO mostraron un mayor número de defectos re specto a los animales simple KO tanto a nivel de su maduración epididimaria como de su habilidad para capacitarse e interactuar con el ovocito. Mientras que la mayoría de los animales DKO exhibieron solo defectos específicos en la capacidad fertilizante de sus espermatozoides, un tercio de los mismos mostró un inesperado fenotipo de epidídimo-orquitis, con niveles alterados de moléculas inflamatorias y espermatozoides no viables en el epidídimo. Diferentes estudios realizados con el fin de esclarecer el origen de los fenotipos observados mostraron que los ratones DKO exhibían claros defectos en la diferenciación del epitelio epididimario y acidificación luminar que resultaron más severos en los animales con fenotipo inflamatorio, apoyando a estos defectos como posibles responsables de los diferentes fenotipos observados. Experimentos realizados con células en cultivo demostraron que CRISP1 es capaz de modular vías de señalización en las células principales, sugiriendo que este sea el mecanismo por el cual las CRISP actúan sobre el epitelio. En conjunto, estas observaciones indican la relevancia de las proteínas CRISP para el funcionamiento del epidídimo y fertilidad masculina, contribuyendo a una mejor comprensión de los mecanismos involucrados tanto en la maduración espermática como en la característica inmunotolerancia del epidídimo, con claras implicancias para la fisiología y patología epididimaria humana.