Citocromo P450 reductasas y metabolismo redox en Trypanosoma cruzi

• Autores: Portal, Patricio
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Paveto, María Cristina
• Materia: TRYPANOSOMA CRUZI; CITOCROMO P450; CITOCROMO P450 REDUCTASA; METABOLISMO; DETOXIFICACION; SINTESIS DE ERGOSTEROL; TRYPANOSOMA CRUZI; CYTOCHROME P450; CYTOCHROME P450 REDUCTASE; METABOLISM; DETOXIFICATION; ERGOSTEROL SYNTHESIS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La citocromo P450 reductasa (CPR) es una flavoproteína que coordina latransferencia de electrones desde el NADPH hacia distintas hemoproteínas, como loscitocromo P450 (CYPs), el citocromo b5, y la hemooxigenasa. Los CYPs seencuentran involucrados tanto en la síntesis de compuestos endógenos, tales comoesteroles y ácidos grasos, como en la activación y detoxificación de compuestosexógenos. Pese a que existen numerosos genes CYP funcionales en mamíferos,existe sólo una CPR en cada especie. La producción de una clase especial deesteroles, entre los que se incluyen el ergosterol y otros metil-esteroles, es unaimportante vía metabólica involucrada en el crecimiento y la viabilidad celular demicroorganismos eucarióticos, como protozoos u hongos, que se encuentra ausenteen mamíferos. En T. cruzi se han identificado y caracterizado bioquímicamente unafamilia de genes integrada por tres putativas CPRs, llamadas TcCPR-A, TcCPR-B y TcCPR-C, cuyas secuencias poseen los dominios conservados para FMN, FAD y NADPH. TcCPR-A carece del domino hidrofóbico amino terminal. Lasobreexpresión de TcCPR-B en epimastigotes incrementa su resistencia a drogas,sugiriendo su participación en el metabolismo de detoxificación del parásito. En labúsqueda de un rol fisiológico para las TcCPRs, en el presente trabajo se analizó elefecto de la sobreexpresión de las mismas, centrándose principalmente en su posibleparticipación en la biosíntesis de esteroles. Una cepa de Saccharomyces cerevisiaedeficiente para CPR fue utilizada en ensayos de complementación con las TcCPRsrecombinantes de T. cruzi. La baja tasa de crecimiento y la disminución de laresistencia al ketoconazole de la levadura mutante, lograron revertirse parcialmentesólo con TcCPR-B y -C. La sobreexpresión de TcCPR-A en células de epimastigotesresulta letal, produciendo un aumento del contenido de ADN, una morfologíaaberrante y numerosas alteraciones ultraestructurales. La sobreexpresión de TcCPRBy -C incrementó la biosíntesis de ergosterol y la relación NADP+/NADPH. Losparásitos transgénicos con mayor contenido de ergosterol presentaron un aumento enel orden de membrana, con la respectiva disminución de la endocitosis. Notablemente, TcCPR-B se ha encontrado en reservosomas mientras que TcCPR-Cse ha localizado en el retículo endoplasmático. Los resultados obtenidos en esta Tesisjunto al correspondiente análisis bibliográfico permiten proponer un rol para las TcCPRs en mecanismos de estrés (TcCPR-A), en reacciones de detoxificación (TcCPR-B) y en la biosíntesis de esteroles (TcCPR-C).
Cytochrome P450 reductase (CPR) is a flavoprotein that coordinates transfer ofelectrons from NADPH to various hemoproteins such as cytochrome P450 (CYPs),cytochrome b5, and heme oxygenase. CYPs are involved both in the synthesis ofendogenous compounds, such as sterols and fatty acids, as in the activation anddetoxification of exogenous compounds. Although there are numerous functional CYP genes in mammals, there is only one CPR in each species. Sterol production isan important metabolic pathway involved in cell growth and viability. Eukaryoticmicroorganisms such as protozoa and fungi produce a special class of sterols absentin mammals, including ergosterol and other methyl-sterols. It has been identified andbiochemically characterized three putative CPRs in Trypanosoma cruzi, called TcCPR-A, TcCPR-B and TcCPR-C. These sequences have the characteristicconserved domains for FMN, FAD and NADPH. However TcCPR-A lacks the Nterminalhydrophobic domain. Overexpression of TcCPR-B epimastigotes of T. cruziincreased drug resistance, suggesting it involvement in detoxification metabolism ofthe parasite. In search for a physiological role of TcCPRs, function of these enzymesand the effect of overexpression were analyzed, focusing mainly on their possibleinvolvement in sterol biosynthesis. A Saccharomyces cerevisiae mutant, CPRdeficient strain, was used in complementation assays with recombinant TcCPRs. Only TcCPR-B and -C partially succeed to reverse low growth rate and decreasedresistance to ketaconazole of the mutant. Overexpression of TcCPR-A is lethal inepimastigote cells, producing an increase in DNA content, aberrant morphology andnumerous ultrastructural alterations. TcCPR-B and -C overexpression increasedergosterol biosynthesis and NADP+/NADPH ratio. Moreover, transgenic parasitespresent more ergosterol and higher membrane order, with a corresponding decreasein endocytosis. Notably, TcCPR-B was found in reservosomas, while TcCPR-C waslocated in the endoplasmic reticulum. Results obtained in this Thesis suggest a rolefor TcCPRs in stress mechanisms (TcCPR-A), in detoxification reactions (TcCPR-B)and in biosynthesis of sterols (TcCPR-C).
Fil: Portal, Patricio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.