Replicación de plásmidos en Escherichia coli recBC sbcBC

• Autores: Bellani, Marina
• Año de publicación: 2002
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Sánchez de Rivas, Carmen
• Materia: ESCHERICHIA COLI; REPLICACION; RECOMBINACION; PLASMIDO; MULTIMEROS; PRIA; GAMMA DELTA; ESCHERICHIA COLI; REPLICATION; RECOMBINATION; PLASMID; MULTIMERS; PRIA; GAMMA DELTA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Este trabajo estudia la replicación de plásmidos en Escherichia coli recBC sbcB sbcCD, un contexto Rec+,en el cual se amplifican procesos de recombinación que involucran intermediarios conteniendo extremos doblecadena (en función de la deficiencia en RecBCD). En este contexto genético, plásmidos con diversos origenesde replicación acumulan multimeros lineales de muy alto peso molecular denominados HMW Se re-evaluó elproceso de generación de multimeros HMW en el contexto recBC sbcBC, a la luz de los nuevos conceptosvigentes acerca de la interrelación replicación / recombinación. Durante la primer etapa del trabajo, se utilizó el sistema de recombinación especifico-de-sitio del transposónγδ para poner a punto un sistema de complementación regulable, que permitiera generar células conteniendoun mínimo porcentaje de multimeros, para analizar luego la síntesis de HMW a lo largo de la curva de crecimiento. Utilizando este sistema, se demostró que las células recBC sbcBCD pueden sintetizar multimeros delplásmido descontroladamente, durante las primeras horas de la fase estacionaria. La capacidad de replicardescontroladamente el plásmido durante la fase estacionaria está determinada por las condiciones de cultivoy depende en parte de la respuesta de fase estacionaria, gobernada por el regulador de la respuesta generalal estrés σˢ. Una vez establecida la cinética de acumulación de HMW, se realizó un análisis genético para individualizarlas funciones celulares involucradas en la síntesis de estos multímeros. Se analizó la incidencia de anular funcionesde recombinación (RecA, RecF, RecR, LexA) y funciones involucradas en el re-inicio de la replicaciónsobre una horquilla restaurada (PriA, PriC, Rep), sobre la capacidad de las células de sintetizar HMW. La comprobaciónde que PriA resulta indispensable para la generación de HMW en un contexto RecBC- SbcBC-,constituye una evidencia de que la generación de HMW involucra el colapso de intermediarios normales dereplicación del plásmido y el reinicio de la replicación por un mecanismo alternativo. En base a los resultados reportados, se proponen dos modelos para explicar el mecanismo de generaciónde HMW, que involucran el colapso de un intermediario de replicación y el restablecimiento de la replicaciónpor un mecanismo de invasión/replicación entre multimeros lineales (similar al que utiliza T4 en su etapa tardíade replicación) o por un mecanismo de tipo círculo rodante (equivalente al utilizado por el fago ʎ para generarconcatémeros).
This work studies plasmid replication in Escherichia coli recBC sbcBC, a Rec+ background, in which recombinationprocesses involving linear DNA (or DNA molecules containing a double strand end) are amplified, giventhe deficiency in RecBCD characteristic of this genetic context. In recBC sbcBC cells, plasmids with diversereplication origins, were reported to accumulate high molecular weight linear multimers (HMW). During thecourse of this work we have re-evaluated the phenomenon of HMW synthesis, in terms of the current understandingof the link between replication, recombination and repair. Acomplementation system was designed, based on the site-specific recombination system from transposonγδ, which permitted the reduction of the percentage of HMW in the culture to a minimum, in order to analyze thekinetics of HMW accumulation along the growth curve. This system allowed us to demonstrate that recBCsbcBC cells can synthesize plasmid multimers in an unregulated manner, during the first hours of stationaryphase. The ability of non-growing cells to replicate the plasmid in an uncontrolled manner during stationaryphase is determined by growth conditions and depends in part on the stationary phase response, which is regulatedby σˢ (the regulator of the general stress response). A genetic analysis was performed in order to characterize the cellular functions involved in HMW synthesis. We analyzed the effect of inactivating recombination functions (RecA, RecF, RecR, LexA) or genes involved inre-initiating replication upon replication fork repair (PriA, PriC, Rep), on the ability of the cells to synthesize HMW. PriA proved to be essential for HMW synthesis in a RecBC- SbcBC- strain, providing strong evidencefor a model for HMW synthesis involving replication fork collapse and re-initiation of plasmid replication throughan alternative mechanism. We postulate two models to explain the alternative mechanisms to initiate the synthesisof HMW in a recBC sbcBC context.
Fil: Bellani, Marina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.