Efecto de la irradiación UV-C en la secreción y contenido de los exosomas derivados de Células Madre Mesenquimales derivadas de Pluripotentes

• Autores: Biani, María Celeste
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Luzzani, Carlos Daniel
• Materia: CELULAS MADRE MESENQUIMALES; EXOSOMAS; BYSTANDER EFFECT; RESPUESTA AL DAÑO DEL ADN; MESENCHYMAL STEM CELLS; EXOSOMES; BYSTANDER EFFECT; DNA DAMAGE RESPONSE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células madre mesenquimales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (CMM-DP) constituyen una alternativa interesante a las células madre mesenquimales clásicas en medicina regenerativa. Sus propiedades terapéuticas, tales como multipotencialidad y capacidad inmunomoduladora se deben tanto a la liberación de factores solubles (citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento), como a la secreción de vesículas extracelulares. Los exosomas son vesículas extracelulares pequeñas con tamaños que rondan entre los 50 y 120 nm, que se originan en la vía endocítica y contienen lípidos, proteínas y ARN que reflejan el tipo celular que les dio origen y su estado fisiológico. Diversas investigaciones han demostrado que los exosomas participan en la comunicación intercelular a través de un fenómeno conocido como bystander effect. Mediante este efecto una célula con fenotipo normal adquiere un fenotipo alterado al recibir señales secretadas por la célula afectada por un agente estresante. Este mecanismo de comunicación podría ser una estrategia para desencadenar una respuesta global y coordinada para hacer frente a una perturbación a la homeostasis celular. En particular, la respuesta al daño al ADN (DDR del inglés Damage Response) causada ante la exposición a radiación modula la secreción de exosomas en distintos modelos experimentales. En este trabajo investigamos la implicancia del estrés genómico y la activación de la DDR causado por irradiación UV-C en la secreción, el contenido y el efecto biológico de los exosomas derivados de CMM-DP. Desarrollamos un sistema experimental que permitió inducir estrés genómico en las CMM-DP, mediante la irradiación con tres intensidades de UV-C (254 nm, 0,001 J/cm2, 0,01 J/cm2 y 0,1J/cm2). Evaluamos la activación de la DDR mediante la expresión y el análisis de la ubicación subcelular de p53 y la fosforilación H2AX, observando que la dinámica de respuesta al daño es dosis dependiente. Por otro lado, determinamos que la expresión de genes involucrados tanto en la vía endosomal como en la síntesis de exosomas, no se ven alterados en CMM-DP bajo estrés genómico en nuestro sistema experimental. Para obtener una muestra de exosomas libre de contaminantes proteicos, en el laboratorio pusimos a punto una nueva metodología de aislamiento de vesículas extracelulares basada en la cromatografía de exclusión molecular. A partir del aislamiento de exosomas de CMM-DP bajo estrés genómico y su cuantificación mediante Tunable Resistive Pulse Sensing, observamos que la irradiación no produjo cambios en la cantidad de vesículas secretadas. Sin embargo, los exosomas provenientes de células irradiadas no mostraron las mismas propiedades pro migratorias que son típicas de los exosomas de CMM-DP no irradiadas sobre células blanco. Por último, un análisis proteómico semicuantitativo del contenido exosomal demostró que la activación de DDR causada por UV-C produce la formación de exosomas con cargo alterado, sobrerrepresentando proteínas con propiedades inhibitorias de la migración resultando en un repertorio menos estromal. Nuestros resultados demuestran que los efectos de la irradiación UV-C se traducen en una modulación del contenido de los exosomas de CMM-DP, generando un cambio en su efecto biológico, disminuyendo la migración celular, y por lo tanto sus propiedades regenerativas.
Mesenchymal Stem Cells derived from Pluripotent Stem cells (iPS-MSC) constitute an interesting alternative to classical Mesenchymal Stem Cells in regenerative medicine. Their properties, such as multipotentiality and immunomodulatory capacities are due to the secretion of soluble factors (cytokines, chemokines, growth factors) and extracellular vesicles. Exosomes are small extracellular vesicles ranging from 50 to 120 nm, that originate from the endosomal pathway and contain lipids, proteins and RNA that reflect their cell of origin and its physiological state. Previous reports indicate that exosomes exert a role in cellular communication participating in a phenomenon known as Bystander effect. Through this effect a cell expressing a normal phenotype acquires an altered phenotype upon receiving signals secreted by a stressed cell. This communication mechanism could be a strategy to trigger a global and coordinated response to deal with a disturbance in cellular homeostasis. In particular, the DNA Damage Response (DDR) caused by exposure to radiation modulates the exosome secretion in several experimental models. In this work, we assess the implication of genomic stress and DDR activation caused by UV-C radiation on the secretion, content and biological effects of iPS-MSC derived exosomes. We developed an experimental system that allowed the induction of genomic stress in iPS-MSC by irradiation with three UV-C intensities (254 nm, 0,001J/cm2, 0,01 J/cm2 y 0,1 J/cm2). We evaluated the activation of DDR through the expression and analysis of subcellular location of p53 and H2AX phosphorylation, observing a dose-dependent response dynamic. On the other hand, we determined that the expression of genes involved in both the endosomal pathway and exosome biogenesis are not altered in iPS-MSC under genomic stress in our experimental system. In order to obtain a protein-free exosome sample, we developed a Size Exclusion Chromatography based vesicle isolation methodology. From the isolation of iPS-MSC exosomes under genomic stress and their quantification by Tunable Resistive Pulse Sensing, we did not observe changes in the number of secreted vesicles compared to that of non-irradiated cells. However, exosomes from irradiated cells were unable to promote cell migration in their target cells as exosomes from MSC typically do. Finally, a label-free proteomic analysis revealed that UV-C induced DDR produces sEVs with an altered cargo, rich in migration-inhibiting proteins, and resulting in a less stromal-oriented repertoire. Our results show that the effects of UV-C irradiation translate into a modulation of iPS-MSC derived exosome cargo. This content modulation may produce a change in their biological effect in target cells, decreasing cell migration and hence diminishing their regenerative capacities.
Fil: Biani, María Celeste. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.