Efecto de la irradiación UV-C en la secreción y contenido de los exosomas derivados de Células Madre Mesenquimales derivadas de Pluripotentes - Biani, María Celeste (2022)
Las células madre mesenquimales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (CMM-DP) constituyen una alternativa interesante a las células madre mesenquimales clásicas en medicina regenerativa. Sus propiedades terapéuticas, tales como multipotencialidad y capacidad inmunomoduladora se deben tanto a la liberación de factores solubles (citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento), como a la secreción de vesículas extracelulares. Los exosomas son vesículas extracelulares pequeñas con tamaños que rondan entre los 50 y 120 nm, que se originan en la vía endocítica y contienen lípidos, proteínas y ARN que reflejan el tipo celular que les dio origen y su estado fisiológico. Diversas investigaciones han demostrado que los exosomas participan en la comunicación intercelular a través de un fenómeno conocido como bystander effect. Mediante este efecto una célula con fenotipo normal adquiere un fenotipo alterado al recibir señales secretadas por la célula afectada por un agente estresante. Este mecanismo de comunicación podría ser una estrategia para desencadenar una respuesta global y coordinada para hacer frente a una perturbación a la homeostasis celular. En particular, la respuesta al daño al ADN (DDR del inglés Damage Response) causada ante la exposición a radiación modula la secreción de exosomas en distintos modelos experimentales. En este trabajo investigamos la implicancia del estrés genómico y la activación de la DDR causado por irradiación UV-C en la secreción, el contenido y el efecto biológico de los exosomas derivados de CMM-DP. Desarrollamos un sistema experimental que permitió inducir estrés genómico en las CMM-DP, mediante la irradiación con tres intensidades de UV-C (254 nm, 0,001 J/cm2, 0,01 J/cm2 y 0,1J/cm2). Evaluamos la activación de la DDR mediante la expresión y el análisis de la ubicación subcelular de p53 y la fosforilación H2AX, observando que la dinámica de respuesta al daño es dosis dependiente. Por otro lado, determinamos que la expresión de genes involucrados tanto en la vía endosomal como en la síntesis de exosomas, no se ven alterados en CMM-DP bajo estrés genómico en nuestro sistema experimental. Para obtener una muestra de exosomas libre de contaminantes proteicos, en el laboratorio pusimos a punto una nueva metodología de aislamiento de vesículas extracelulares basada en la cromatografía de exclusión molecular. A partir del aislamiento de exosomas de CMM-DP bajo estrés genómico y su cuantificación mediante Tunable Resistive Pulse Sensing, observamos que la irradiación no produjo cambios en la cantidad de vesículas secretadas. Sin embargo, los exosomas provenientes de células irradiadas no mostraron las mismas propiedades pro migratorias que son típicas de los exosomas de CMM-DP no irradiadas sobre células blanco. Por último, un análisis proteómico semicuantitativo del contenido exosomal demostró que la activación de DDR causada por UV-C produce la formación de exosomas con cargo alterado, sobrerrepresentando proteínas con propiedades inhibitorias de la migración resultando en un repertorio menos estromal. Nuestros resultados demuestran que los efectos de la irradiación UV-C se traducen en una modulación del contenido de los exosomas de CMM-DP, generando un cambio en su efecto biológico, disminuyendo la migración celular, y por lo tanto sus propiedades regenerativas.