Rol de las poblaciones naturales de Trypanosoma cruzi en la infección connatal y la reactivación chagásica por inmunosupresión : diagnóstico y caracterización molecular

• Autores: Burgos, Juan Miguel
• Año de publicación: 2008
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Schijman, Alejandro Gabriel
• Materia: ENFERMEDAD DE CHAGAS; DIAGNOSTICO MOLECULAR; TRATAMIENTO; REACTIVACION; LINAJE DE T. CRUZI; TIPIFICACION MOLECULAR; HISTOTROPISMO CLONAL; CHAGAS DISEASE; MOLECULAR DIAGNOSTIC; TREATMENT; REACTIVATION; T. CRUZI LINEAGE; MOLECULAR CHARACTERIZATION; CLONAL HISTOTROPISM
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La enfermedad de Chagas es causada por el protozoario Trypanosoma cruzi. Descrita por primera vez en 1909, hoy afecta a 8 millones de personas en 21 países de América. La infección puede transcurrir en forma indeterminada o producir diferentes patologías. También presenta diferentes formas e incidencias de transmisión, capacidades de reactivación y sensibilidades al tratamiento etiológico. La hipótesis de histotropismo clonal postula que dicha variabilidad responde a las diferentes poblaciones parasitarias con tropismos y capacidades infectivas específicas. En este sentido, dos grandes linajes y cinco sub-linajes de T. cruzi (Tc I y Tc IIa-e) fueron descriptos en base a diferentes estrategias de clasificación. En este trabajo de tesis presentamos el desarrollo de estrategias de amplificación por PCR para la detección y caracterización molecular de T.cruzi, que permitieron un diagnóstico sensible de la infección y el análisis directo de las poblaciones parasitarias naturales a partir de muestras clínicas, sin necesidad de recurrir al aislamiento previo del parásito en cultivo. La utilización de la reacción de PCR para el diagnóstico de la infección connatal mostró una sensibilidad del 100% en los menores de 6 meses (mayor que la alcanzada por técnicas de referencia) y del 73,8% entre los pediátricos mayores. El diagnóstico molecular de pacientes indeterminados y con cardiopatía chagásica crónica presentó sensibilidades del 54% y 50%, respectivamente. Las mayores sensibilidades halladas en el diagnóstico de mujeres embarazadas (69,8%) y pacientes co-infectados con VIH (100%) obedecen a la inmuno-modulación que ellos padecen. En todos los casos, las sensibilidades observadas están en íntima relación con los niveles de parasitemia. En este sentido, mediante PCR-competitiva cuantificamos una reducción de hasta 1000 veces en dichos niveles durante la historia natural del Chagas connatal, desde el nacimiento hasta la fase indeterminada en el paciente pediátrico. Comprobamos que el éxito terapéutico está en relación al inicio temprano del tratamiento y no a los linajes parasitarios infectantes, caracterizados como Tc IId en el 94,7% de los hijos de madres infectadas de Argentina, Bolivia y Paraguay. El diagnóstico por PCR mostró ser un marcador sensible de respuesta parasitológica, indicador temprano de curación en pacientes menores de 6 meses, y de falla terapéutica en los pacientes mayores, indeterminados y crónicos. En el estudio de la transmisión connatal se observó la existencia de agrupamiento familiar de la infección, la mayor frecuencia de transmisión a partir de madres con altas parasitemias y el pasaje de todo el contenido parasitario sanguíneo materno hacia el recién nacido, sin selección por parte de la placenta (estudiado mediante tipificación molecular basada en la variabilidad del minicírculo). En pacientes con cardiopatía Chagásica crónica sometidos a trasplante cardíaco se halló una asociación positiva entre el daño cardíaco y la presencia de T. cruzi en los sitios de la lesión tisular. El diagnóstico molecular permitió la detección temprana de la reactivación de la infección en este grupo, anticipándose, en promedio, 56 días a tal evento. Dicho diagnóstico molecular comenzó a aplicarse en el seguimiento de estos pacientes, permitiendo un accionar terapéutico anticipado con mejor pronóstico. Estos pacientes mostraron altas frecuencias de Tc I en sus infecciones, no descripto anteriormente en nuestro país en la infección humana. Sin embargo, no se encontró asociación entre la cardiopatía y un linaje parasitario particular. Las técnicas moleculares empleadas permitieron también realizar diagnóstico diferencial de reactivación del sistema nervioso central, en pacientes con serología positiva para T. cruzi y VIH, marcadora de SIDA. La caracterización directa de las poblaciones parasitarias en distintos tejidos (provenientes de pacientes co-infectados con VIH y trasplantados cardíacos) permitió observar histotropismo clonal en la infección natural en el hombre, descripto anteriormente en el modelo animal.
Chagas disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. It was first described in 1909 by Carlos Chagas. Nowadays 8 million people are infected in 21 American countries. Different pathologies, incidence rates, reactivation frequencies and sensitivities to specific treatment were observed. The histotropic clonal hypothesis explain that different manifestations of Chagas disease are due to specific tissue tropism of different parasitic populations. Two T. cruzi lineages and 5 sub-lineages (Tc I and Tc IIa-e) were described on the basis of different characterization strategies. In this study we developed and improved strategies for detection and characterization of T. cruzi infection. Those PCR strategies allow us to study T.cruzi infection directly from infected human specimen samples, without parasite culture amplification. Molecular diagnosis of T. cruzi infection showed a sensitivity of 100% and 73.8% for congenital infected people younger than 6 months or older, respectively. Moreover, molecular diagnosis showed sensitivities of 54% and 50% for indeterminate and chronic Chagas disease patients and 69.6% and 100% for pregnant women and patients with HIV, respectively. The correlation between molecular diagnosis sensitivity and the levels of parasitemia was confirmed by competitive-quantitative PCR. We measured a reduction of the parasitemias from recent congenital infection up to the indeterminate phase of infection. Higher cure rates were obtained when etiological treatment starts near the infection episode, with no correlation with the detected infecting parasite population (characterized as Tc IId in 94.7% of congenital newborns from Argentina, Bolivia and Paraguay). PCR strategy showed to be a good method to analyze parasitological response, as an indicator of cure in patients younger than 6 months and an indicator of treatment failure in older ones. We observed a clustering of congenital infection where higher maternal parasitemias levels appear as a risk factor for vertical transmision. Moreover, we conclude that the whole maternal parasitic population is transmitted to newborns (analyzed by molecular typing of kinetoplastid DNA). No differences among T. cruzi lineages regarding differential incidence of vertical transmission was observed. Molecular diagnosis was an usefull tool to detect reactivation of Chagas disease in heart trasplanted patients and T. cruzi infection directly from the lesion in infected tissues. We found an association between PCR positive findings and myocarditis in heart explants of transplanted patients but not a significant association with the T. cruzi lineage. These patients showed several T. cruzi lineages with higher rates for Tc I, feature firstly described in this study for the human infection in the southern cone of America. PCR detected parasitemias 56 days earlier than standard methods allowing better outcomes of treatment reactivation. Molecular amplification was a useful tool for differential diagnosis of T.cruzi infection in HIV patients with involvement of the CNS, leading to a better outcome. Moreover, direct characterization of parasite lineages from different tissue samples (in trasplanted and HIV patients) showed a differential histotropic distribution in the natural human infection, feature that had been only described in the animal model.
Fil: Burgos, Juan Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.