Estudio de señales fluctuantes de Ca2+ citoplasmático en Saccharomyces cerevisiae

• Autores: Tarkowski, Nahuel
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Aguilar, Pablo Sebastián; Ponce Dawson, Silvina Martha
• Materia: SACCHAROMYCES; CALCIO; FEROMONA; FERTILIZACION; MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA; SACCHAROMYCES; CALCIUM; PHEROMONE; FERTILIZATION; FLUORESCENCE MICROSCOPY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células de levadura, Saccharomyces cerevisiae, constituyen un sistema ideal donde estudiar los mecanismos de señalización celular. En este sentido, las células haploides de S. cerevisiae son un sistema de particular interés ya que responden a la feromona sexual secretada por las células del tipo sexual opuesto generando una secuencia de eventos, algunos de los cuales son observables a simple vista. Entre otros, se detiene el ciclo celular y se inicia un crecimiento polarizado hacia la célula secretora que lleva, eventualmente, a la fusión de las células y a la generación de un cigoto. Estudios previos habían demostrado que la incorporación de calcio durante la respuesta a la feromona era necesaria para coordinar los genes involucrados en la transducción de señales y la supervivencia celular. En esta Tesis se estudió la dinámica del calcio durante la respuesta a la feromona con una aproximación inédita: a través del estudio de células únicas. Con este fin se introdujo, desarrolló y validó el sensor fluorescente de calcio GCaMP6f en S. cerevisiae. Mediante experimentos de microscopía de fluorescencia in vivo, identificación y seguimiento de células únicas se mostró que la feromona no genera, como estaba reportado, un aumento continuo en los niveles citosólicos de calcio sino aumentos transitorios en forma de ráfagas de corta duración. Más importante aún, la presencia de la feromona parece traducirse en un aumento en la frecuencia de aparición de estas ráfagas de calcio sugiriendo que la información transmitida por el calcio está codificada en la distribución temporal de estas ráfagas. En levaduras existen al menos dos vías de incorporación de calcio del medio extracelular, un sistema denominado HACS formado por el complejo Mid1-Cch1 y un sistema llamado LACS regulado por la proteína Fig1. Analizando cepas carentes de las proteínas Fig1 y Mid1, se demostró en esta Tesis que las mismas son necesarias para el aumento en la frecuencia de aparición de las ráfagas de calcio feromona-dependiente. Con el fin de analizar el efecto de las diferentes vías de flujo de calcio hacia y desde cada uno de los reservorios internos sobre la dinámica de calcio citosólico durante la respuesta a la feromona construimos y analizamos de manera sistemática un conjunto de cepas mutantes afectadas en todos los transportadores de calcio conocidos en S. cerevisiae: las proteínas importadoras de Ca2+ vacuolar Pmc1 y Vcx1, la exportadora vacuolar Yvc1 y Pmr1, la ATPasa importadora de Ca2+ del aparato de Golgi. Los resultados obtenidos sugieren que la proteína Fig1 es responsable de gran parte de la dinámica de calcio durante la respuesta a la feromona. Inesperadamente observamos que Yvc1 también tiene un papel importante durante esta respuesta. A partir del modelado y la simulación de la dinámica del calcio citosólico y de la vacuola logramos asignar características diferenciales a las distintas vías de calcio las cuales explican parte de los resultados obtenidos.
Yeast cells, Saccharomyces cerevisiae, constitute an ideal system in which to study cell signaling mechanisms. In this sense, the haploid cells of Saccharomyces cerevisiae are a system of particular interest since they respond to the sexual pheromone secreted by cells of the opposite sexual type, generating a sequence of events, some of which are observable with the naked eye. Among others, the cell cycle is arrested and polarized growth towards the secretory cell is initiated, eventually leading to cell fusion and the generation of a zygote. Previous studies had shown that calcium incorporation during pheromone response was necessary to coordinate genes involved in signal transduction and cell survival. In this Thesis, we used single cell videmicroscopy monitoring to address the dynamics of intracellular calcium during the pheromone response. For this, the fluorescent calcium sensor GCaMP6f was introduced, developed and validated in Saccharomyces cerevisiae. Through in vivo fluorescence microscopy experiments followed by single cell segmentation and monitoring, it was shown that the pheromone does not generate, as previously reported, a single continuous increase in cytosolic calcium levels, but transient increases in bursts of short duration. Likewise, the presence of the pheromone seems to translate into an increase in the frequency of appearance of these calcium bursts, suggesting that the information transmitted by calcium is encoded in the temporal distribution of these bursts. In yeast there are at least two calcium import pathways, a system called HACS formed by the Mid1-Cch1 complex and a system called LACS regulated by the Fig1 protein. Analyzing strains lacking Fig1 and Mid1 proteins, it was shown in this Thesis that they are necessary for the increase in the frequency of appearance of pheromone-dependent calcium bursts. In order to analyze the effect of different calcium flux pathways to and from each of the internal reservoirs on cytosolic calcium dynamics during pheromone response, we systematically constructed and analyzed a set of affected mutant strains in all additionally known S. cerevisiae’s calcium transporters: the vacuolar Ca2+ importer proteins Pmc1 and Vcx1, the vacuolar exporter Yvc1 and Pmr1, the Ca2+ importer ATPase of the Golgi apparatus. The results obtained suggest that the Fig1 protein is responsible for much of the calcium dynamics during the response to the pheromone. Unexpectedly, we observed that Yvc1 also plays an important role during this response. Modeling of cytosolic and vacuolar calcium dynamics enabled us to assign specific features to the different calcium pathways which explained part of our experimental results.
Fil: Tarkowski, Nahuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.