Interacciones tripartitas en la regulación de la función génica del virus respiratorio sincicial : antiterminador trasnscripcional M2-1, fosfoproteína P y ARN

• Autores: Molina, Ivana Gisele
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: de Prat Gay, Gonzalo
• Materia: VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL HUMANO; M2-1; ARN; FOSFOPROTEINA P; COOPERATIVIDAD; CRISTALOGRAFIA DE PROTEINAS; PROTEINAS INTRINSECAMENTE DESORDENADAS; INTERACCION; HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS; M2-1; RNA; PHOSPHOPROTEIN P; COOPERATIVITY; CRYSTALLOGRAPHY OF PROTEINS; INTRINSICALLY DISORDERED PROTEINS; INTERACTION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El virus respiratorio sincitial humano (RSV) es la principal causa de infecciones virales pediátricas del tracto respiratorio inferior y de hospitalización infantil. Este virus pertenece al orden Mononegavirales, familia Pneumoviridae. Su genoma consiste en una molécula de ARN simple cadena, de polaridad negativa, no segmentado de 15 kb que se encuentra encapsulado por la proteína de la nucleocápside N. La replicación y transcripción del genoma de RSV son llevadas a cabo por el complejo ARN polimerasa, conformado por la ARN polimerasa L, la fosfoproteína P que actúa como andamiaje para el ensamblado del complejo y M2-1 un antiterminador transcripcional. M2-1 es una proteína de unión a ARN homotetramérica, que contiene un motivo de unión a Zn+2, mejora la procesividad transcripcional y es exclusivo de pneumovirus. P es una proteína extendida que consiste en un dominio de tetramerización de cuatro hélices flanqueadas por un dominio N-terminal intrínsecamente desordenado y un dominio C- terminal parcialmente ordenado y se sabe que forma un complejo no globular con M2-1 en proporción 1:1. En este trabajo de tesis, se realizó el estudio de los determinantes termodinámicos y cinéticos que definen la reacción de interacción entre la proteína M2-1 con ARN sintéticos y con fragmentos de P diseccionando de esta manera la región mínima de unión con el antiterminador. M2-1 se une a dos moléculas de ARN de 13 nucleótidos o más por tetrámero, desestabilizando la estructura secundaria del ARN al unirse. El análisis cuantitativo fino muestra una cooperatividad positiva, indicativa de una asimetría conformacional en el tetrámero. Es una asociación bimolecular rápida seguida de reordenamientos lentos correspondientes a un mecanismo de ajuste inducido, lo cual podría proporcionar una descripción secuencial de los eventos temporales de la cooperatividad. En segunda instancia mapeamos el sitio de interacción de P con M2-1 en la región amino-terminal (PNTET), presentando una estequiometría 1:1 y una constante de afinidad en el orden nanomolar similar a la observada para la proteína entera. Vimos una ganancia en el contenido α-hélice global del complejo M2- 1:PNTET, sugiriendo la existencia de un reordenamiento de la estructura secundaria de P. Dadas las transiciones conformacionales de P abordamos el análisis de la base termodinámica de esta interacción. Vimos que existe una compensación entrópica/entálpica en un rango de temperatura donde el complejo de replicación se ensambla y desensambla. Por último, pudimos cristalizar la región de M2-1 que une ARN y P, y por experimentos de dicroísmo circular observamos que posee un despliegue cooperativo de dos estados y es un dominio compacto e independiente del resto de la molécula. La caracterización biofísica, bioquímica y estructural de estas proteínas esenciales para el ciclo biológico de RSV constituye uno de los puntos de partida para el desarrollo de compuestos antivirales y vacunas. Estos resultados nos ayudan a comprender mejor los mecanismos de replicación de los pneumovirus, lo cual puede ser extrapolado también a virus emparentados.
Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the main cause of pediatric lower respiratory tract viral infections and of childhood hospitalization. This virus belongs to the order Mononegavirales, family Pneumoviridae. Its genome consists of a 15 kb non-segmented negative polarity single stranded RNA molecule that is encapsulated by the nucleocapsid N protein. RSV replication and transcription genome is carried out by the RNA polymerase complex, conformed by the RNA polymerase L, the phosphoprotein P that acts as scaffold for the assembly of the complex and the M2-1 a transcriptional antiterminator. M2-1 is a homotetrameric RNA binding protein, which contains a Zn+2 binding motif, improves transcriptional processivity and is unique to pneumovirus. P is an extended protein consisting of a tetramerization domain of four helices flanked by an intrinsically disordered N-terminal domain and a partially ordered C-terminal domain. It is known by previous reports that P forms a non-globular complex with M2-1 with a 1:1 ratio. In this thesis, we study the thermodynamic and chemical determinants that define the binding of M2-1 protein with synthetic RNA and M2-1 with P fragments dissecting in this way the minimum binding region with the anti-terminator. M2-1 binds two molecules of 13 nucleotides or more per tetramer, destabilizing the secondary structure of the RNA upon binding. The fine quantitative analysis shows a positive cooperativity, indicating a conformational asymmetry in the tetramer. It is a rapid bimolecular association followed by slow rearrangements corresponding to an induced adjustment mechanism, which can provide a sequential description of the temporary events of the cooperative. Furthermore, we mapped the interaction site of P with M2-1 in the amino-terminal region (PNTET), presenting a 1:1 stoichiometry and an affinity constant in the nanomolar order similar for the whole protein. We saw a gain in the global α-helix content of the M2-1:PNTET complex, suggesting the existence of a rearrangement of the P secondary structure. Given the conformational transitions of P we address the analysis of the thermodynamic basis of this interaction. We observed that there is an entropic/enthalpic compensation in a temperature range where the replication complex is assembled and disassembled. Finally, we were able to crystallize the region of M2-1 that binds RNA and P, and by circular dichroism experiments we could determine that it has a cooperative unfolding of two states and is a compact domain and independent of the rest of the molecule. The biophysical, biochemical and structural characterization of these essential proteins for the biological RSV cycle is a starting point for the development of antiviral compounds and vaccines. These results help us to understand the mechanisms of replication of pneumoviruses, which can also be extrapolated to related viruses.
Fil: Molina, Ivana Gisele. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.