Bases moleculares de interacciones virus-hospedador : análisis biofísico y estructural de la interacción de la proteína E1A de Adenovirus con su blanco específico Retinoblastoma...

• Autores: González Foutel, Nicolás Sebastián
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Chemes, Lucía Beatriz
• Materia: INTERACCIONES VIRUS-HOSPEDADOR; MOTIVOS LINEALES; PROTEINA INTRÍNSECAMENTE DESORDENADA; ADE1A; RETINOBLASTOMA; VIRUS-HOST INTERACTIONS; LINEAR MOTIFS; INTRINSICALLY DISORDERED PROTEIN; ADE1A; RETINOBLASTOMA PROTEIN
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Virus patogénicos como Adenovirus, Papilomavirus y Poliomavirus poseen proteínas capaces de interactuar con el supresor de tumores Retinoblastoma (pRb), controlador central del ciclo celular eucariótico. Dichas interacciones se establecen en sitios utilizados por pRb para unir blancos endógenos como el surco A/B donde se une el factor de transcripción E2F y el surco LxCxE donde se unen proteínas que poseen el motivo LxCxE. Estos virus hacen mímica de motivos lineales de interacción altamente conservados, y generalmente presentes en regiones intrínsecamente desordenadas, para interferir efectivamente con la red celular y tomar el control de la célula huésped conduciendo en algunos casos a transformación celular y oncogénesis. La oncoproteína viral E1A del Adenovirus (AdE1A) es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) y se une a pRb a través de dos motivos lineales necesarios para desplazar a E2F, el motivo E2F y el motivo LxCxE, que se encuentran separados por una región de 70 residuos o “linker”. En este trabajo, sugerimos que ciertas características de esta proteína desempeñan un papel esencial en los mecanismos de desregulación de pRb. Dado el limitado conocimiento mecanístico y estructural de alta resolución con respecto a AdE1A, su interacción con pRb y la contribución de la región “linker” en esta interacción, nos propusimos caracterizarlos para revelar información que servirá para comprender mejor las interacciones virus-hospedador. En primer lugar, desarrollamos un protocolo de expresión recombinante de AdE1A y mutantes individuales de motivos, con rendimientos de 9 mg/L y pureza superior al 95%. Experimentos biofísicos evidenciaron que AdE1A es un monómero intrínsecamente desordenado con radio hidrodinámico extendido y migración anómala en gel. En segundo lugar, ensayos de interacción muestran que AdE1A se une a pRb con estequiometría 1:1 y una muy alta afinidad (KD = 24 pM). Aunque los sitios individuales unen a pRb con menor afinidad (≈ KD = 110nM) que la E2F celular (KD = 1 nM), el modelado del sistema como un arreglo de dos motivos unidos por un “linker” de longitud óptima y altamente flexible permite explicar la potenciación de su afinidad global y la efectividad de la proteína AdE1A en el desplazamiento de E2F. En tercer lugar, estudios estructurales de RMN permitieron la asignación completa de la cadena carbonada de AdE1A y su caracterización a nivel de estructura secundaria y propensiones conformacionales evidenciaron su naturaleza desordenada y flexible. AdE1A se une a pRb a través de dos sitios independientes conformados por residuos centrales de los motivos E2F y LxCxE modulados por residuos flanqueantes con función complementaria, más interacciones débiles en la región “linker”. El análisis de la región “linker”, sugiere que existe un fino balance entre repulsión de cargas y contactos hidrofóbicos débiles con pRb en regiones de interacción secundarias, las cuáles se encuentran altamente conservadas a nivel evolutivo y que contribuirían a su capacidad de interacción con múltiples blancos celulares. Los resultados del presente trabajo contribuyen a comprender las bases moleculares de las interacciones entre proteínas de virus y hospedador y los mecanismos mediante los cuales los virus toman control de la célula huésped, lo cual allana el camino para el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el cáncer de etiología viral.
Pathogenic viruses such as Adenovirus, Papillomavirus and Polyomavirus harbor proteins that are able to interact with the Retinoblastoma tumor suppressor protein (pRb), central regulator of the eukaryotic cell cycle. These interactions are established at sites used by pRb to interact with endogenous targets, for example the A/B groove where the E2F transcription factor binds and the LxCxE groove where proteins harboring the LxCxE motif bind. These viruses mimic highly conserved linear interaction motifs generally present in intrinsically disordered regions to effectively interfere with the cellular network and take control of the host cell, leading in some cases to cellular transformation and oncogenesis. The E1A viral oncoprotein from Adenovirus (AdE1A) is an intrinsically disordered protein (IDP) and binds to pRb through two linear motifs necessary to displace E2F, the E2F motif and the LxCxE motif, which are separated by a 70- residues region or "linker". In this work, we suggest that certain features of this protein play an essential role in the viral-mediated pRb dysregulation mechanism. Given the limited high- resolution mechanistic and structural knowledge regarding AdE1A, its interaction with pRb and the contribution of the "linker" region in this interaction, we set out to characterize them to reveal information that provides a better understanding of virus-host interactions. First, we developed a recombinant expression protocol of AdE1A and single motif mutants, with yields of 9 mg/L and purity over 95%. Biophysical experiments showed that AdE1A is an intrinsically disordered monomer with extended hydrodynamic radius and anomalous gel migration, characteristic of an IDP. Second, interaction assays show that AdE1A binds to pRb with 1:1 stoichiometry and a very high affinity (KD = 24 pM). Although individual sites bind to pRb with lower affinity (≈ KD = 110nM) than cellular E2F (KD = 1 nM), the modeling of the system as an arrangement of two motifs thethered by a highly flexible "linker" of optimal length allows to explain its global affinity enhacement and the effectiveness of the AdE1A protein in the displacement of E2F. Third, high resolution structural NMR studies allowed the complete assignment of the AdE1A backbone and its characterization at secondary structure and backbone conformational propensity level, revealing its disordered and flexible nature. AdE1A binds to pRb through two independent sites formed by key residues in the E2F and LxCxE motifs modulated by flanking residues, plus weak interactions in the "linker" region. The analysis of the "linker" region suggests that evolution has kept a fine balance between charge repulsion and weak hydrophobic contacts with pRb at secondary interaction regions, which are highly conserved and would contribute to E1A’s ability to function as a “hub protein”, interacting with multiple cellular targets. The results of this work contribute to understanding the molecular basis of virus-host protein-protein interactions and the mechanisms by which viruses take control of the host cell, which paves the way for the development of therapeutic strategies against cancer with viral etiology.
Fil: González Foutel, Nicolás Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.