Interacciones tripartitas en la regulación de la función génica del virus respiratorio sincicial : antiterminador trasnscripcional M2-1, fosfoproteína P y ARN - Molina, Ivana Gisele (2018)
El virus respiratorio sincitial humano (RSV) es la principal causa de infecciones virales pediátricas del tracto respiratorio inferior y de hospitalización infantil. Este virus pertenece al orden Mononegavirales, familia Pneumoviridae. Su genoma consiste en una molécula de ARN simple cadena, de polaridad negativa, no segmentado de 15 kb que se encuentra encapsulado por la proteína de la nucleocápside N. La replicación y transcripción del genoma de RSV son llevadas a cabo por el complejo ARN polimerasa, conformado por la ARN polimerasa L, la fosfoproteína P que actúa como andamiaje para el ensamblado del complejo y M2-1 un antiterminador transcripcional. M2-1 es una proteína de unión a ARN homotetramérica, que contiene un motivo de unión a Zn+2, mejora la procesividad transcripcional y es exclusivo de pneumovirus. P es una proteína extendida que consiste en un dominio de tetramerización de cuatro hélices flanqueadas por un dominio N-terminal intrínsecamente desordenado y un dominio C- terminal parcialmente ordenado y se sabe que forma un complejo no globular con M2-1 en proporción 1:1. En este trabajo de tesis, se realizó el estudio de los determinantes termodinámicos y cinéticos que definen la reacción de interacción entre la proteína M2-1 con ARN sintéticos y con fragmentos de P diseccionando de esta manera la región mínima de unión con el antiterminador. M2-1 se une a dos moléculas de ARN de 13 nucleótidos o más por tetrámero, desestabilizando la estructura secundaria del ARN al unirse. El análisis cuantitativo fino muestra una cooperatividad positiva, indicativa de una asimetría conformacional en el tetrámero. Es una asociación bimolecular rápida seguida de reordenamientos lentos correspondientes a un mecanismo de ajuste inducido, lo cual podría proporcionar una descripción secuencial de los eventos temporales de la cooperatividad. En segunda instancia mapeamos el sitio de interacción de P con M2-1 en la región amino-terminal (PNTET), presentando una estequiometría 1:1 y una constante de afinidad en el orden nanomolar similar a la observada para la proteína entera. Vimos una ganancia en el contenido α-hélice global del complejo M2- 1:PNTET, sugiriendo la existencia de un reordenamiento de la estructura secundaria de P. Dadas las transiciones conformacionales de P abordamos el análisis de la base termodinámica de esta interacción. Vimos que existe una compensación entrópica/entálpica en un rango de temperatura donde el complejo de replicación se ensambla y desensambla. Por último, pudimos cristalizar la región de M2-1 que une ARN y P, y por experimentos de dicroísmo circular observamos que posee un despliegue cooperativo de dos estados y es un dominio compacto e independiente del resto de la molécula. La caracterización biofísica, bioquímica y estructural de estas proteínas esenciales para el ciclo biológico de RSV constituye uno de los puntos de partida para el desarrollo de compuestos antivirales y vacunas. Estos resultados nos ayudan a comprender mejor los mecanismos de replicación de los pneumovirus, lo cual puede ser extrapolado también a virus emparentados.