Modulación de los receptores GABA Ap1 por especies reactivas del oxígeno y benzodiazepinas

• Autores: Beltrán González, Andrea Natalia
• Año de publicación: 2015
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Calvo, Daniel Juan
• Materia: RECEPTOR GABA A; RECEPTOR GABA AP1; ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO; BENZODIAZEPINAS; RETINA; GABA A; RECEPTOR; GABA AP1 RECEPTOR; REACTIVE OXYGEN SPECIES; BENZODIAZEPINES; RETINA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian generalmente con estrés oxidativo celular,pero también tienen un importante rol como mensajeros celulares en la señalización redox, porejemplo, modulando la actividad de los receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Hasta elmomento no se habían demostrado acciones directas de las ROS sobre los receptores GABAA. En estetrabajo se estudiaron los efectos de las ROS sobre la función del receptor GABAAρ1. Se expresaronreceptores homoméricos GABAAρ1 humanos en oocitos de Xenopus laevis y se registraronelectrofisiológicamente las respuestas evocadas por GABA en presencia o ausencia de ROS. Lasrespuestas GABAAρ1 se potenciaron significativamente en presencia de H2O2, en forma reversible ydosis dependiente. Los efectos potenciadores se atenuaron en presencia de un scavenger deradicales libres, ácido lipoico, y un inhibidor de la reacción de Fenton, deferoxamina. Para identificarlos residuos involucrados en las acciones de las ROS se realizaron ensayos de protección química decisteínas con agentes selectivos de sulfhidrilos y mutagénesis sitio dirigida. Cada subunidad ρ1contiene solo tres residuos de cisteína, dos extracelulares en el Cys-loop (C177 y C191) y unaintracelular (C364) en el bucle TM3-TM4. La sustitución de la C364 por alanina o serina generóreceptores mutantes completamente insensibles a la potenciación por ROS. Las cisteínas del Cys-loopno resultaron esenciales para la modulación por ROS. Nuestros resultados muestran que las ROSpotencian la función de los receptores de GABAAρ1 y que la cisteína intracelular C364 es el sensorpara las acciones de ROS. Por otro lado, varios subtipos de receptores GABAA son modulados alostéricamente porbenzodiazepinas (BZD), drogas ampliamente usadas como ansiolíticos, hipnóticos sedantes yanticonvulsivos. Se identificó un sitio de unión a BDZs de alta afinidad y al menos tres sitiosadicionales de baja afinidad en variantes heteroméricos y homomericos de receptores GABAA. Sinembargo, nunca se había reportado la modulación de receptores GABAAρ1 por BDZs y durantemucho tiempo se los asumió como completamente insensibles. En el presente estudio, se expresaronheterólogamente receptores GABAAρ1 en oocitos y se registraron las respuestas evocadas por GABAen presencia y ausencia de BDZs. El diazepam y 4'-Cl diazepam modularon las respuestas GABAAρ1 enel rango micromolar de forma reversible, dependiente de la concentración e independiente delvoltaje. El diazepam potenció las corrientes de Cl- evocadas por GABA y el 4'- Cl diazepam produjoefectos bifásicos dependiendo de la concentración de GABA, mientras que Ro15-4513 y alprazolamactuaron como moduladores negativos. Las acciones de las BDZs resultaron insensibles a flumazenil. Otras BZDs no mostraron actividad significativa en condiciones experimentales equivalentes. Nuestros resultados sugieren que las BZDs pueden modular la función del receptor GABAAρ1 deforma selectiva y diferencial.
Reactive oxygen species (ROS) are normally involved in cell oxidative stress but also play arole as cellular messengers in redox signaling, for example modulating the activity ofneurotransmitter receptors and ion channels. However, the direct actions of ROS on GABAA receptorswere not previously demonstrated. In the present work, we studied the effects of ROS on GABAAρ1receptor function. Human homomeric GABAAρ1 receptors were expressed in Xenopus laevis oocytesand GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of ROS. GABAAρ1 receptor-mediated responses were significantly enhanced in a dose-dependent andreversible manner by H2O2. Potentiating effects were attenuated by a free radical scavenger, lipoicacid, or an inhibitor of the Fenton reaction, deferoxamine. Chemical protection of cysteines byselective sulfhydryl reagents and site-directed mutagenesis studies were used to identify proteinresidues involved in ROS actions. Each ρ1 subunit contains only three cysteine residues, twoextracellular at the cys loop (C177 and C191) and one intracellular (C364) at the TM3-TM4 linker. Mutant GABAAρ1 receptors in which C364 was exchanged by alanine or serine were completelyinsensitive to ROS potentiation implying that this site, rather than a cystein in the Cys-loop, isessential for ROS modulation. Our results show that the function of GABAAρ1 receptors is enhancedby ROS and that the intracellular C364 is the sensor for ROS actions. On the other hand, many GABAA receptor subtypes are allosterically modulated bybenzodiazepines (BDZs), which are drugs extensively used as anxiolytics, sedative-hypnotics andanticonvulsants. One high-affinity site and at least three additional low-affinity sites for BDZrecognition have been identified in several heteromeric and homomeric variants of the GABAAreceptors. However, the modulation of homomeric GABAAρ1 receptors by BDZs was not previouslyrevealed, and these receptors, for a long a time, were assumed to be fully insensitive to the actionsof these drugs. In the present study, GABAAρ1 receptors were heterologously expressed in oocytesand GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of BDZs. GABAAρ1 receptor-mediated responses were modulated by diazepam and 4´-Cl diazepam in themicromolar range, in a concentration-dependent, voltage-independent and reversible manner. Diazepam produced potentiating effects on GABA-evoked Cl- currents and 4´-Cl diazepam inducedbiphasic effects depending on the GABA concentration, whereas Ro15-4513 and alprazolam werenegative modulators. BDZ actions were insensitive to flumazenil. Other BDZs showed negligibleactivity at equivalent experimental conditions. Our results suggest that GABAAρ1 receptor functioncan be selectively and differentially modulated by BDZs.
Fil: Beltrán González, Andrea Natalia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.