Modulación por óxido nítrico de receptores ionotrópicos de GABA

• Autores: Gasulla, Javier
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Calvo, Daniel Juan
• Materia: RECEPTORES GABA A; RECEPTORES GABA P1; OXIDO NITRICO; S-NITROSILACION; RETINA; HIPOCAMPO; GABA A RECEPTOR; GABA P1 RECEPTOR; NITRIC OXIDE; S-NYTROSYLATION; RETINA; HIPPOCAMPUS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El NO es una molécula altamente difusible y reactiva producida en el sistema nerviosoque actúa como mensajero neuronal y participa en procesos fisiológicos y patológicos. El NOmodula la actividad de numerosos receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Enparticular, los GABAARs pueden ser modulados por agentes rédox y por NO, aunque los efectosy mecanismos de este último no están claros. En esta tesis, caracterizamos los efectos del NO sobre GABAρ1Rs expresados de formaheteróloga y estudiamos la actividad de los GABAARs fásicos y tónicos de células piramidalesen rebanadas de hipocampo con distintos niveles de NO. Los receptores homoméricos GABAρ1 se expresaron en ovocitos de Xenopus laevis, ylas respuestas evocadas por GABA se registraron electrofisiológicamente, en presencia yausencia de donantes de NO. Las respuestas se potenciaron significativamente por el NO deforma rápida, reversible y dosis-dependiente. El bloqueo químico de las cisteínas mediantereactivos selectivos para sulfhidrilos previno la potenciación por NO, indicando que lascisteínas participan de la modulación. Cada subunidad ρ1 tiene solo tres cisteínas, las dosextracelulares que forman el cys-loop (C177 y C191) y una intracelular (C364). El reemplazopor alanina de la C364 no modificó los efectos del NO sobre el receptor, lo que sugiere que el NO potencia los GABAρ1Rs a través de una interacción con el cys-loop extracelular. Por otra parte, en rebanadas de hipocampo, se realizaron registros con la técnica depatch-clamp en configuración célula entera, y se estudiaron los efectos del NO sobre los GABAARs. Las corrientes fásicas se registraron aplicando puffs de GABA y, las corrientestónicas se midieron analizando la IH antes y después de la aplicación de bicuculina (BIM). Elnivel de NO se incrementó por la aplicación de donantes de NO y se disminuyó bloqueando laproducción de la NOS. El incremento en los niveles de NO no modificó significativamente la actividad de los GABAARs. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de NO endógeno potenció lacorriente GABAérgica tónica y la evocada por puffs de GABA. Estos resultados indican que los efectos del NO sobre los GABAARs son dependientesde la subunidad y sugieren que las acciones del NO en el hipocampo estarían en parte mediadaspor la modulación de la actividad inhibitoria.
NO is a highly diffusible and reactive molecule produced in the nervous system that actas a neuronal signal mediating both physiological and pathological mechanisms. NO canmodulate the activity of neurotransmitter receptors and ion channels. In particular, GABAARcan be modulated by several redox agents and by NO, but the effects and mechanisms of thismodulation were not clearly determined. In the present work, we characterized the effects of NO on the GABAρ1R andexamined the function of phasic and tonic GABAAR on pyramidal cells of acute hippocampalslices under different NO levels. Homomeric GABAρ1Rs were heterologously expressed in Xenopus oocytes and GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of NOdonors. Responses were significantly enhanced in a dose-dependent, fast and reversible mannerby NO. Chemical protection of cysteines by selective sulfhydryl reagents prevented the NOeffects indicating that cysteines are involved in NO actions. The ρ1 subunits contain only threecysteine residues, two extracellular at the cys-loop (C177 and C191) and one intracellular (C364). Mutation of C364 by alanine did not change the effects of NO on GABAρ1R,suggesting that GABAρ1R function can be enhanced by NO acting at the extracellular cys-loop. On the other hand, in hippocampal slices, whole-cell patch clamp technique was used tostudy the effects of NO on GABAAR. Phasic currents were evoked by puff application of GABA and tonic currents were determined through monitoring IH before and after application ofbicuculine. NO level was increased by application of NO donors or decreased by blocking the NOS. Exogenously applied NO, had no effects on GABAARs. Meanwhile, depletion ofendogenous level of NO enhanced both types of GABAergic currents. These results indicate that NO actions on GABAARs are extremely subunit dependentand suggest that physiological effects of NO on hippocampus can be in part mediated bymodulation of the inhibitory synaptic activity.
Fil: Gasulla, Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.