Síntesis de exopolisacáridos en Xanthomonas sp.

• Autores: Vojnov, Adrián Alberto
• Año de publicación: 1996
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Dankert, Marcelo Alberto
• Materia: POLISACARIDOS; XANTANO; BIOSINTESIS; XANTHOMONAS; GENES GUM; POLYSACCHARIDE; XANTHAN; BIOSYNTHESIS; XANTHOMONAS; GUM GENES
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Xanthomonas campestris es un patógeno de plantas causando la putrefacción negra en las hojas de las crucíferas. Además, produce un polisacárido extracelular (EPS), de gran importancia industrial, llamado xantano. La estructura de su unidad repetitiva es ( Jansson, P. E. et al., 1975. Carbohydr. Res. 45: 274): (ver figura en el pdf). La biosíntesis in vitro de xantano ha sido estudiada en detalle en nuestro laboratorio (Ielpi et al., 1993. Bacteriol., 175:2490). Se ha determinado que ésta ocurre en al menos dos etapas. En la primera etapa, la unidad repetitiva se ensamba secuencialmente sobre un poliprenol pirofosfato. En una segunda etapa, las unidades repetitivas son polimerizadas y el EPS formado liberado en el medio de crecimiento. Se conoce que los genes involucrados en la biosíntesis del xantano, 12 genes, están agrupados en un segmento de ADN de 16 Kb ( Barrre et al., 1986.Int. Biol. Macromol, 8: 372) y parte de los genes involucrados en la transferencia de azúcares estan identificados (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., EEUU), pero no se realizó un estudio detallado de la caracterización de mutantes no productoras de xantano, como asi también, aún se desconoce la ubicación de los genes responsable del proceso de polimerización y exportación. En este trabajo de tesis, presentamos la caracterización de algunas mutantes defectuosas en la producción de EPS, en la cual, en dos de ellas, se realizó un estudio más detallado: X. campestris 8004:: Tn525 y 8004:: Tn570. La primera mutante falló en producir el pentasacárido, unidad repetitiva del xantano, y solamente tres azúcares fueron transferidos al prenil pirofosfato intermediario, esta unidad repetitiva truncada no obstante pudo ser polimerisada. El polímero truncado formado tiene la estructura de una celulosa sustituida alternadamente por residuos de manosa y tiene un potencial interés industrial. El transposón, responsable de la mutación, fue localizado dentro del gen gumk. Por lo tanto, este gene codificaría la glicosil transferasa IV, que cataliza la transferencia de ácido glucurónico al trisacárido manosil-celobiosa. La segunda mutante estudiada resultó ser capaz de sintetizar in vitro el lípido pentasacárido, unidad de repetitiva, con cualquiera de los tres dadores de azúcares utilizados: UDP-Glc, GDP-Man y UDP-GlcA, pero incapaz de polimerizar estas unidades. El Tn5, en la cepa N °70, fue localizado 15 bp "upstream" del sitio de iniciación del gen gumB (primer gen del grupo). Esto suguiere que gumB está involucrado en el proceso de polimerización. Un segundo aspecto desarrollado en este trabajo de tesis fue el efecto de los grupos no glicosídicos en el proceso de polimerización. Se demostró que los niveles más altos de polimerización, en el EPS producido por la cepa mutante N° 25, fueron obtenidos cuando 30 % de las unidades repetitivas truncadas se encontraban acetiladas. Por otra parte, el fosfoenolpiruvato (dador de los grupos piruvatos) se comportó, sobre este polímero, como un regulador positivo en las reacciones de polimerización. En la cepa silvestre solo se observó cierta inhibición en la reacción de polimerización con ambos dadores de grupos no glicosídicos estudiados. Es importante destacar que la unidad truncada que sintetiza la cepa N° 25 no posee grupos piruvatos en su estructura. Finalmente, estudios preliminares mostraron la obtención in vitro de glucanos β -( 1,2 ) lineales y cíclicos utilizando diferentes preparaciones de X. campestris. Algunos resultados preliminares suguieren un posible rol de estos glucanos en el proceso de infección.
Xanthomonas campestris is a plant pathogen causing the disease called black rot. In addition, it produces an extracellular polysaccharide (EPS), of great industrial importance, called xanthan. The structure of its repeating unit is (Jansson, P.E. et al., 1975.Carbohydr.Res.45:274). (see in pdf). The in vitro biosynthesis of xanthan gum has been studied in our laboratory in detail (Ielpi et al., 1993. J. Bacteriol., 175: 2490). It occurs in at least two stages. In the first, the repeating unit is sequentially assembled linked to a polyprenol trough a diphosphate bridge. In a second stage, the repeating units are polimerized and liberated into the growth medium. It has been reported that the genes involved in xanthan biosynthesis are located in a cluster of 12 genes (Barrère et al., 1986. Int. J. Biol. Macromol, 8:372). This cluster was found to have about 16 Kb and some of the genes involved in the sugar transfer were identified (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., USA), but the location of the genes responsible for the polimerization and export process is until unclear. In this thesis work, we reported the characterization of some EPS defective strains, two of them in more detail: X. campestris 8004::Tn525 and 8004::Tn570. The first mutant failed to produce the pentasaccharide repeating unit. Only three sugars were transferred to the prenil phosphate intermediate and polimerized. The truncated polymer formed has the structure of a mannose substituted cellulose and has potential industrial interest. The transposon responsible of the mutation was located within gumK gene. Therefore, this gene codify for the glycosyl transferase IV, which catalyzes the glucuronic acid transfer to the mannosil-cellobiosetrisaccharide. The second mutant turned out to be able to synthesize in vitro the lipid linked pentasaccharide repeating unit, from the three sugar donors: UDP-Glc, GDP-Man and UDP-GlcA, but unable to polimerize it. The Tn5 was located 15 bp upstream of the initiation site of gumB gene (first gene of the cluster). It was suggested that gumB is involved in the polimerization process. A second aspect developed in this thesis work was the effect of non glycosidic group on polymerization process. It was shown that higher polymerization levels was obtained when 30 % of the repeating units were acetylated. On the other hand, the phosphoenolpiruvate itself (cetal pyruvic donor) behaved as a positive regulator on the polymerization reactions. On the wild strain only certain inhibition on the polimerization reaction was observed with both donors of groups non glicosydic studied. It is important to emphasize that the truncated unity that synthesizes the strain N° 25 is not possessing pyruvil groups in its srtructure. Finally, preliminary studies showed the in vitro synthesis of lineal and cyclic ß(1,2) glucans by different preparations of X. campestris. A possible rol of these glucans in the infection process was suggested.
Fil: Vojnov, Adrián Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.