Caracterización bioquímica y estructural de glicosiltransferasas bacterianas

• Autores: Salinas, Silvina R.
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ielpi, Luis
• Materia: GLICOSILTRANSFERASAS; XANTANO; GUMK; GUM I; XANTHOMONAS CAMPESTRIS; CAMBIOS CONFORMACIONALES; PROTEINAS DE MEMBRANA; GLYCOSYLTRANSFERASAS; XANTHAN; GUM K; GUM I; XANTHOMONAS CAMPESTRIS; CONFORMATIONAL CHANGES; MEMBRANE PROTEINS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los polisacáridos juegan un papel esencial en el metabolismo celular y en el funcionamiento delos organismos. Son sintetizados empleando enzimas glicosiltransferasas (GTs), cuyaspropiedades determinan el tamaño y la estructura del producto final. Muchas GTs estánlocalizadas en membranas celulares, dificultando su purificación y caracterización. En estetrabajo de Tesis se estudian bioquímica y biofísicamente dos GTs que participan en la síntesisdel polisacárido xantano producido por Xanthomonas campestris. La primer GT es GumI, de la cual sólo había escasos antecedentes genéticos. En esta Tesis sepresenta la primera caracterización bioquímica y funcional de GumI, demostrando su actividadglicosiltransferasa previamente propuesta. Se realizaron ensayos de complementación funcional,demostrando su actividad manosiltransferasa in vivo. Además, se demostró que GumI está unidaa la membrana, y que la interacción está mediada por interacciones hidrofóbicas yelectrostáticas. GumI fue purificada y su actividad fue estudiada in vitro, obteniéndose losparámetros óptimos de reacción. GumI dio origen a una nueva familia, GT-94, en laclasificación Carbohydrate Active EnZymes. Finalmente, mediante ensayos de cristalización seobtuvieron agujas bidimensionales que al presente no fueron aptas para resolver la estructura de GumI por cristalografía de rayos-X. La segunda GT es GumK, cuya estructura cristalina se resolvió en el laboratorio y, como GumI,es una GT monotópica de membrana. Se profundizó sobre las bases moleculares de la unión asus sustratos y a la membrana. Se realizaron diferentes mutaciones sobre la zona propuesta deunión a la membrana, demostrando la complejidad de dicha interacción. Además, se realizaronestudios por simulación computacional con el fin de obtener la estructura del complejo GumK/UDP-GlcA. El modelo obtenido explicaría la especificidad por este sustrato. Estudiosrealizados en este trabajo mediante diversas técnicas -tales como proteólisis limitada,fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica de titulación, resonancia magnéticanuclear y dispersión de rayos-X a bajo ángulo- sugieren fuertemente la presencia de cambiosconformacionales disparados por la unión de UDP-GlcA.
Polysaccharides, which play a crucial role in cellular metabolism and in the performance oforganisms, are synthesized by glycosyltransferase (GT) enzymes, whose properties determinethe size and structure of the final product. Many GTs are localized in cellular membranes,difficulting their purification and characterization. In this Thesis, two GTs (GumI and GumK)which participate in the synthesis of the polysaccharide xanthan produced by Xanthomonascampestris were studied biochemically and biophysically. The genetic background data on GumI is limited. This Thesis reports the first functional andbiochemical characterization of GumI, demonstrating its previously proposedglycosyltransferase activity. Functional complementation demonstrated its in vivomannosyltransferase activity. Results also show that GumI is a membrane-associated protein,and that the interaction is mediated by hydrophobic and electrostatic forces. GumI was purifiedand its activity was studied in vitro, obtaining optimal reaction parameters. Finally,crystallization experiments allowed obtaining bidimensional needles, which were not suitable toresolve GumI structure by X-ray crystallography. GumK, whose structure was resolved in the laboratory, is a monotopic GT, like GumI. This Thesis deepened on the molecular basis of the binding to its substrate and the membrane. Mutagenesis of residues of the region proposed for membrane binding was performed, resultingin no-soluble protein and thus demonstrating the complexness of membrane interaction. Moreover, computational simulation studies were carried out with the aim to obtain a model ofthe GumK/UDP-GlcA structure. The model obtained may explain the GumK specificity for thissubstrate. Studies performed by various techniques, such as fluorescence, circular dichroism,isothermal titration calorimetry, nuclear magnetic resonance, and small-angle X-ray scattering,strongly suggest the presence of conformational changes in GumK triggered by the UDP-GlcAbinding.
Fil: Salinas, Silvina R.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.