Prenil-fosfo-azúcares derivados de galactosa : Su metabolización en eucariotes

• Autores: Iñon de Iannino, Nora
• Año de publicación: 1983
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Dankert, Marcelo Alberto
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La biosíntesis de las glicoproteínas tipo asparagina se inicia a través del llamado "Ciclo del Dolicol". Este ciclo comienza con la transferencia de N-acetilglucosamina-1-fosfato de UDP-GlcNAc al dolicol monofosfato para dar Dol-PP-GlcNAc y continúa con la adición sucesiva de una GlcNAc, nueve manosas y tres glucosas para formar Dol-PP-(GlcNAc)2Man9Glc3. Esta segunda GlcNAc y las cinco primeras manosas son cedidas por sus respectivos nucleótido azúcares, las cuatro manosas restantes y los tres residuos glucosa son transferidos a partir de dolicol monofosfato manosa y de dolicol monofosfato glucosa, respectivamente. El Dol-PP-(GlcNAc)2 ManGlc a su vez transfiere el oligosacárido completo a un péptido naciente y una vez ligado a proteína, el oligosacárido, a través de una serie de reacciones denominadas "procesamiento", es sometido a una degradación parcial por medio de glicosidasas específicas perdiendo todos los residuos glucosa y algunos residuos manosa. En etapas posteriores, por adición de nuevos azúcares, se decide si la glicoproteïna formada será del tipo "alta manosa" o "complejo". En todo este "Ciclo del Dolicol“ participan únicamente dos dolicol monofosfato azúcares,derivados de manosa y de glucosa, respectivamente. En este trabajo se investigó si otro doliquil derivado, el dolicol monofosfato galactosa, participaba en este ciclo. Para ello se preparó Dol-P-(14C)Gal utilizando enzimas de bacterias (Acetobacter xylinum) y se estudió la incorporación de (14C)galactosa a los distintos componentes del ciclo del dolicol v a glicoproteínas. Se encontró que: 1°) El Dol-P-(14C)Gal era capaz de transferir (14C)galactosa a un lípido difosfato oligosacárido que se denominó Dol-PP-oligosacGal, con propiedades prácticamente idénticas a las del lípido difosfato oligosacárido glucosilado arriba mencionado.Esta transferenciase encontró incubando diferentes tejidos (cerebro, hígado, timo, páncreas) con Dol-P-(14C)Gal en presencia de Triton X100 y analizando la radioactividad soluble en un extracto cloroformo: metanol: agua (1:1:0,3) por los métodos clásicos (cromatografía en papel y en columnas de DEAE-celulosa, hidrólisis ácida total, hidrólisis ácida suave, etc.). 2°) El análisis de la porción sacarídica reveló que en realidad se trataba de dos oligosacáridos (denominados oligosac-Gall y oligosac-Gal2), a los cuales se les asignó, en base a estudios de permetilación, oxidación con periodato, tratamiento con α-manosidasa, endo N-acetilglucosaminidasa H, reducción alcalina, acetolisis parcial, etc, las siguientes estructuras: (Ver las dos estructuras en la tesis). 3°) Tanto el oligosac-Gal1 como el oligosac-Gal2 eran transferidos a proteina. Esto se demostró incubando Dol-PP-oligosac-(14C)Gal con un preparado microsomal de hígado de rata en presencia de Triton X-lOO y Mn++,y analizando la radioactividad incorporada a material insoluble en TCA por tratamiento con proteasa, aislamiento de los glicopéptidos en columna de Bio Gel P 6, electroforesis de los mismos en buffer de pH ácido y alcalino, y tratamientocon endo N-acetilglucosaminidasa H.. 4°) En las condiciones de transferencia a proteína, a diferencia de lo que ocurre con los oligosacáridos glucosilados, el oligosacGal1 y el oligosac-Gal2 no eran procesados. Esto se demostró comparando el tamaño de los oligosacáridos galactosilados liberados con endo N-acetilglucosaminidasa H con el de estandares de oligosacáridos glucosilados. 5°) El preparado microsomal utilizado no tenía actividad de glicosidasas lisosomales (a pH=4,5) pero a pH=6,5, condición óptima para la actividad de glicosidasas de Golgi, se detectaron manosidasas y glucosidasas pero no galactosidasas. 6°) A pH=6,5, las glicosidasas en el preparado microsomal degradaron a los oligosacáridos glucosilados (oligosac-Glc1 y oligosacGlc2) hasta llegar a Man5-(GlcNAc)2. 7°) A pH=6,5, debido a la ausencia de actividad galactosidásica, las manosidasas sólo pudieron actuar sobre la rama 1-6 de los oligosacáridos galactosilados. Se encontró que el oligosac-Gal1 pudo llegar a perder hasta cuatro residuos manosa, mientras que el oligosac-Gal2 fue casi insensible, puediendo perder con mucha dificultad una manosa o a lo sumo dos. Finalmente, se discute el papel del Dol-P-Gal en el "Ciclo del Dolicol" asi como el por qué de las diferencias de comportamiento de los oligosacáridos galactosilados formados. Debe destacarse que la síntesis de DoL-P-Gal en eucariotes no ha sido aún demostrada en forma inequívoca. Con los sistemas enzimáticos utilizados en este trabajo no se pudo detectar su formación.
Fil: Iñon de Iannino, Nora. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.