Efectos del sistema regulador CreBC sobre el flujo de carbono en Escherichia coli y su manipulación para incrementar la síntesis de compuestos de interés industrial

• Autores: Godoy, Manuel Santiago
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Pettinari, María Julia
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La supervivencia de un organismo depende, al menos en parte, de su habilidad para sensar y responder a cambios en el ambiente. En las bacterias, los cambios en las características físicas y nutricionales del ambiente generan respuestas inmediatas, a través de la regulación de conjuntos de genes en respuesta a un estímulo específico del ambiente y a señales metabólicas. En el presente trabajo se evaluó el efecto de cambios en CreC, el sensor del sistema regulador de dos componentes CreBC, sobre el metabolismo central de E. coli. Se estudió el efecto de mutaciones en el gen creC en cepas crecidas en medio mineral M9 con glucosa y glicerol comofuente de carbono, y en distintas condiciones de aerobiosis. La ausencia de CreC generó mayores efectos en M9 glucosa y en bajas tensiones de oxígeno tanto para la secreción demetabolitos (acetato, formiato, lactato y succinato) como para las actividades enzimáticas acetato quinasa (ACK) y lactato deshidrogenasa (LDH). De los cuatro metabolitos mencionados, la cepa ΔcreC (DC1060) produjo más acetato, formiato y succinato y menos lactato, y reportóuna mayor actividad ACK y menor actividad LDH. El estudio de los niveles de transcripción a través de fusiones trascripcionales del gen gfp (codifica la proteína verde fluorescente, Gfp) a los promotores de los genes de las enzimasestudiadas ackA (ACK) y ldhA (LDH) confirmaron que la menor actividad LDH de la cepa DC1060 se correspondía con niveles inferiores de transcripto del gen (en la fase exponencial). Para la fusión ackA-gfp, en cambio, los niveles de transcripción fueron leve pero significativamente menores en la cepa mutante respecto a la salvaje (K1060) en esta fase, encontraposición a lo observado para la actividad ACK. La trascripción de este gen en la fase estacionaria, pasó a ser mayor en la cepa DC1060, demostrando un alto nivel de complejidaden la dinámica regulatoria de CreC sobre ackA. Mediante estudios similares a los antes descriptos pero realizados con mutantes para los genes ΔcreB, ΔcreC y la doble mutante ΔcreBC, se estableció que los efectos de CreC están mediados exclusivamente por CreB. Se realizaron ensayos fisiológicos en los que se observó que la cepa mutante es más sensible a agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno y el paraquat, probablemente comoresultado de un estado intracelular más oxidado respecto de la cepa salvaje (como se pudoestablecer a partir de los coeficientes [estanol]/[acetato], y los niveles de NADH/NAD+ intracelulares). También se observó que esta cepa tiene un consumo de oxígeno más bajo (-30%) que la salvaje. Se realizaron ensayos en biorreactor con diferentes niveles de aireación (bajo, medio y alto) ydos fuentes de carbono (glicerol y glucosa) para caracterizar fermentativamente a las cepas K1060 y DC1060, a fin de establecer una estrategia para mejorar la producción de succinato y PHB, en conjunto con los resultados mencionados. Las mayores diferencias entre ambas cepas se observaron nuevamente a bajas concentraciones de oxígeno. De estas diferencias se destacan los siguientes resultados: (i) Nohubo producción de lactato, y los niveles de etanol fueron muy bajos para ambas cepas yfuentes de carbono; (ii) el succinato fue detectable sólo en la cepa mutante con glucosa, pero aniveles inferiores que los obtenidos en los cultivos de frasco agitado; (iii) el formiato y elacetato, en medio mineral con glucosa, se produjeron en mayor cantidad para la cepa ΔcreC; (iv) la relación [etanol]/[acetato] volvió a reflejar un estado de mayor oxidación intracelular enla cepa ΔcreC (sólo con glucosa); (v) en glicerol como fuente de carbono, se observó un lag más pronunciado y una mayor energía de mantenimiento en la cepa DC1060 respecto a la K1060. Cuando se evaluó la producción de PHB mediante la expresión heteróloga de los genes phaCABde R. eutropha, se vio que en glucosa la cepa mutante produce casi un 50% más de estepolímero. Al probar los efectos del bicarbonato sobre la producción de succinato, vimos que la síntesis de este último aumentaba sólo en la cepa mutante. Para ver si era posible mejorar la producción de estos metabolitos, construimos una colección de cepas con distintas mutaciones de forma de anular las vías metabólicas competitivas. Estas mutaciones involucraron a los genes ackA, ldhA, ptsG, adhE y, por su puesto, creC. En el casodel PHB, ninguna de las cepas mejoró el desempeño de la simple mutante ΔcreC, quizás debido a que ya se alcanzó el máximo nivel de polímero tolerable por la célula. En el caso del succinato, además se sobre-expresaron dos carboxilasas de E. coli (la PEP carboxilasa y la PEPcarboxiquinasa), cada una en combinación con la enzima formiato deshidorgenasa (Fdh1) de Candida Boidinii. De las distintas combinaciones estudiadas, la cepa que tuvo mayor producción de succinato fue la triple mutante ΔcreC, ΔackA, ΔadhE, sobre expresando lasenzimas PEP carboxilasa y la Fdh1, llegando a alcanzar una concentración de 6 mM de succinato.
The survival of an organism depends, at least in part, on its ability to sense and respond tochanges in the environment. In bacteria, changes in the physical and nutritional characteristicsof the environment generate immediate responses, controlled through the regulation of setsof genes in response to specific environmental stimuli and metabolic signals. The effect of changes in CreC, the sensor of the two component CreBC control system, on thecentral metabolism of E. coli was evaluated In this work. The effect of mutations in creC oncentral metabolism, were analyzed in M9 mineral medium with glucose and glycerol as thecarbon source, and under different oxygen availability conditions. The absence of CreCgenerated more changes in glucose and low oxygen tensions for the secretion of metabolites (acetate, formate, lactate and succinate) and for the activity of the enzyme acetate kinase (ACK) and lactate dehydrogenase (LDH). Of the four metabolites mentioned, the ΔcreC (DC1060) strain produced more acetate, formate and succinate and less lactate, and reporteda higher activity of ACK and lower activity of LDH. The study of the transcription levels via transcriptional fusions of gfp (coding for the greenfluorescent protein, Gfp), to the promoters of the genes of the enzymes studied: ackA (ACK)and ldhA (LDH), confirmed that the reduced LDH activity of strain DC1060 matched lowerlevels of gene transcript (in exponential phase) For the ackA-gfp fusion, however, transcriptlevels were slightly but significantly lower in the mutant strain compared to the wild type (K1060) at this stage, as opposed to the enzymatic activity observed for ACK. The transcript ofthis gene in the stationary phase became higher in the DC1060 strai n, demonstrating a highlevel of complexity in the regulatory dynamics of CreC over ackA. On similar studies using a ΔcreB mutant, and a ΔcreBC double mutant, it was established thatthe observed effects are exclusively mediated by CreB. Physiological studies indicated that the mutant strain is more sensitive to oxidizing agents suchas hydrogen peroxide and paraquat, probably resulting from a more oxidized intracellular statewhen compared to the wild type (as could be established through the [ethanol] / [acetate]ratio, and the intracellular levels of NADH / NAD+). It was also noted that this strain has a lower oxygen consumption rate than the wild type (-30 %). Tests were performed in a bioreactor with different aeration levels (low, medium and high) and two carbon sources (glycerol andglucose) to characterize the fermentation behavior of K1060 and DC1060 strains in order to establish a strategy to improve the production of succinate and PHB. The largest differences between the two strains were again observed at low oxygen concentrations. These differences can be summarized as: (i) there was no lactate production, and ethanol levels were very lowfor both strains and carbon sources, (ii) succinate was detectable only in the mutant strainwith glucose, but to lower levels than in shake flask cultures, (iii) acetate and formate wereproduced in greater quantities by the ΔcreC strain in mineral medium with glucose, (iv) theratio [ethanol] / [acetate+ again reflects an increased intracellular oxidation state in the ΔcreCstrain (only with glucose), (v) with glycerol as a carbon source, a more pronounced lag andincreased maintenance energy was observed in strain DC1060 compared to K1060. When PHBproduction was evaluated in strains carrying the phaCAB of R. eutropha, the ΔcreC mutantproduced nearly 50% more of this polymer in glucose. When the effects of bicarbonate onsuccinate production were tested, we saw that the synthesis of this acid was only increased inthe mutant strain. To see if it was possible to improve the production of these metabolites, we created acollection of strains with different mutations to eliminate the competitive metabolic pathways. These mutations involved ackA, ldhA, ptsG, creC, and adhE. In the case of PHB, none of thestrains improved the performance of the single mutant ΔcreC, perhaps because the maximum tolerable level of polymer and was already reached by the single mutant. In the case ofsuccinate, the over-expression of two E. coli carboxylases (PEP carboxylase and PEPcarboxykinase) was analyzed, each in combination with the enzyme formate dehydrogenase (Fdh1) of Candida boidinii. Of the various combinations tested, the strain with the highestsuccinate production was the triple mutant ΔcreC, ΔackA, ΔadhE overexpressing PEPcarboxylase and Fdh1, which reached a final concentration of 6 mM succinate.
Fil: Godoy, Manuel Santiago. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.