Uso de proteínas con actividad de chaperona para optimizar la síntesis de productos de interés biotecnológico en Escherichia coli

• Autores: Alvarez, Daniela Soledad
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Pettinari, María Julia
• Materia: PHASINA; ETANOL; 1,3-PROPANODIOL; ESTIRENO; PHASIN; ETHANOL; 1,3-PROPANEDIOL; STYRENE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La phasinas son proteínas asociadas a gránulos intracelulares de polihidroxialcanoatos (PHA), polímeros biodegradables acumulados por muchas bacterias como material de reserva. Además de su función estructural en la cubierta de los gránulos, se ha demostrado que las phasinas tienen funciones regulatorias, y se han desarrollado numerosas aplicaciones biotecnológicas utilizándolas en fusiones proteicas. En nuestro laboratorio hemos estudiado la phasina PhaP de Azotobacter sp. FA8, un productor natural de poli(3-hidroxibutirato) (PHB), el PHA más conocido. En estudios previos en cepas de E. coli recombinante productoras de PHB, hemos observado que la sobreexpresión de phaP permite un mayor crecimiento y una mayor acumulación de polímero, lo que sugiere que PhaP ejerce un efecto promotor del crecimiento. Se observó también que la expresión de phaP tiene un efecto protector inesperado en cepas de E. coli no productoras de PHB, tanto en condiciones normales como en condiciones de estrés, permitiendo un mayor crecimiento y mayor resistencia a estrés oxidativo y estrés térmico. En vista de estos resultados, se caracterizó a esta phasina estructural y funcionalmente, demostrando que actúa como chaperona in vitro, ayudando al plegado de la proteína modelo citrato sintasa, y también in vivo, siendo capaz de reducir el número y tamaño de cuerpos de inclusión formados por una proteína recombinante en E. coli. El objetivo de este trabajo de tesis fue profundizar el análisis de los efectos beneficiosos de la phasina PhaP de Azotobacter sp. FA8 y evaluar su uso para el mejoramiento de cepas de interés biotecnológico. Para ello, se analizó su efecto sobre la tolerancia a diferentes factores de estrés, con especial hincapié en condiciones de estrés que podrían encontrarse en procesos de síntesis de diferentes productos. Se observó que la expresión heteróloga de phaP en E. coli aumenta la tolerancia a biocombustibles como etanol y butanol, y a sustancias químicas como el 1,3- propanodiol. También se observó que la expresión de phaP produce un incremento en la tolerancia de las células al estrés osmótico iónico producido por NaCl, y al no iónico producido por sacarosa. Estos resultados demuestran que la phasina es capaz de proteger a las células del estrés provocado por solventes y condiciones de estrés osmótico, apoyando aún más el rol protector general ejercido por PhaP en E. coli. En función de estos resultados, se evaluó la capacidad de esta phasina de mejorar la obtención de bioproductos en E. coli, particularmente solventes y precursores químicos de interés industrial como etanol, 1,3-propanodiol y estireno. Para ello, se construyeron cepas recombinantes productoras de los distintos compuestos. En todos los casos, en las cepas que sobreexpresan phaP se observó un aumento del crecimiento y del título del producto final, en comparación con la cepa control. Estos resultados demuestran que la expresión de phaP puede mejorar la síntesis de bioproductos de interés industrial en E. coli, y abren el camino para el uso de esta proteína en el desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas.
Phasins are proteins associated with intracellular granules of polyhydroxyalkanoates (PHA), biodegradable polymers accumulated by many bacteria as reserve material. In addition to their structural function in the granule coat, phasins have been shown to have regulatory functions, and numerous biotechnological applications have been developed using them in protein fusions. One of the main working lines in our laboratory is focused on the study of phasin PhaP from Azotobacter sp. FA8, a natural producer of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB), the best known PHA. Previous studies performed on PHB-producing recombinant E. coli strains have shown that overexpression of phaP causes increased growth and greater polymer accumulation, suggesting that PhaP exerts a growth-promoting effect. It was also observed that phaP expression has an unexpected protective effect on non-PHB-producing E. coli strains under both normal and stress conditions, allowing for increased growth and greater resistance to oxidative and heat stress. In view of these results, this phasin was structurally and functionally characterized. The results showed that PhaP acts as a chaperone in vitro, assisting the folding of the model protein citrate synthase, and also in vivo, being able to reduce the number and size of inclusion bodies formed by a recombinant protein in E. coli. The aim of this work was to further analyze the beneficial effects of phasin PhaP from Azotobacter sp. FA8 and to evaluate its use in strain improvement. For this purpose, we analyzed the effect of PhaP on tolerance to different stress factors, with special emphasis on stress conditions that could be encountered in bioprocesses. It was observed that heterologous expression of phaP in E. coli increases tolerance to biofuels such as ethanol and butanol, and to added-value chemicals such as 1,3-propanediol. It was also observed that phaP expression results in increased tolerance to ionic osmotic stress produced by NaCl and non-ionic osmotic stress produced by sucrose. These results demonstrate that PhaP is able to protect cells from solvent stress and osmotic stress conditions, further supporting the general protective role exerted by this phasin in E. coli. Based on these results, we evaluated the capacity of PhaP to improve the synthesis of bioproducts in E. coli, particularly solvents and added-value chemicals. For this purpose, we constructed recombinant strains producing ethanol, 1,3-propanediol and styrene. In all cases, the strains that overexpressed phaP showed increased growth and higher titers of the final product, compared to the control strain. These results show that phaP expression is able to improve the synthesis of bioproducts in E. coli, opening the road for its use in the development of new biotechnological applications.
Fil: Alvarez, Daniela Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.