Reguladores globales en Escherichia coli : su efecto en el metabolismo central y en la síntesis de compuestos de interés biotecnólogico

• Autores: Egoburo, Diego Ezequiel
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Pettinari, María Julia
• Materia: REGULADORES GLOBALES; ARCA; CRA; PHAP; 1,3-PROPANODIOL; ESCHERICHIA COLI; GLOBAL REGULATORS; ARCA; CRA; PHAP; 1,3-PROPANEDIOL; ESCHERICHIA COLI
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La manipulación de reguladores globales es una de las estrategias utilizadas para la construcción de cepas bacterianas adecuadas para la síntesis de bioproductos, debido a que este tipo de reguladores controlan, de forma conjunta, los flujos de carbono y poder reductor. Sin embargo, los efectos pleiotrópicos de estos reguladores pueden variar en diferentes condiciones y a menudo dependen de la cepa de trabajo. En este estudio se analizaron los efectos de ArcA, CreC, Cra y Rob usando mutantes de deleción única de la cepa BW25113 de Escherichia coli (E. coli), la cual está bien caracterizada y completamente secuenciada. La comparación de los efectos de cada regulador sobre la síntesis de los principales metabolitos extracelulares, la tolerancia a varios compuestos y la síntesis de bioproductos nativos y no nativos en diferentes condiciones de crecimiento permitió la discriminación de los fenotipos particulares que se pueden atribuir a las mutantes individuales, y destacó a las mutantes Δcra y ΔarcA, en las que se observaron los efectos más importantes sobre el metabolismo bacteriano. A partir de estos datos, en una prueba de concepto para analizar si sus contextos metabólicos eran adecuados para la síntesis de los biocompuestos reducidos, se utilizaron estas cepas como plataformas para la síntesis de succinato y 1,3-propanodiol (PDO). La mutante Δcra se modificó adicionalmente para potenciar la síntesis de succinato mediante la adición de enzimas que aumentan la disponibilidad de NADH y CO2, logrando un aumento del 80% en comparación con la cepa salvaje. La producción de PDO en la mutante ΔarcA se optimizó mediante la sobreexpresión de la proteína PhaP, que permitió un aumento del 230% en la síntesis del diol en comparación con la cepa salvaje. En un medio semidefinido, usando glicerol como fuente de carbono, los cultivos en biorreactor de esta cepa alcanzaron 24 g.L-1 de PDO después de 48 h, con una productividad volumétrica de 0,5 gL-1h-1.
Manipulation of global regulators is one of the strategies used for the construction of bacterial strains suitable for the synthesis of bioproducts. However, the pleiotropic effects of these regulators can vary in different conditions and are often strain dependent. In this study analyzed the effects of ArcA, CreC, Cra and Rob using single deletion mutants of the well characterized and completely sequenced Escherichia coli (E. coli) strain BW25113. Comparison of the effects of each regulator on the synthesis of major extracellular metabolites, tolerance to several compounds and synthesis of native and non-native bioproducts in different growth conditions allowed the discrimination of the particular phenotypes that can be attributed to the individual mutants, and singled out Cra and ArcA as the regulators with the most important effects on bacterial metabolism. These data were used to identify the most suitable backgrounds for the synthesis of the reduced bioproducts succinate and 1,3-propanediol (PDO). The Δcra mutant was further modified to enhance succinate synthesis by the addition of enzymes that increase NADH and CO2 availability, achieving an 80% increase compared to the parental strain. Production of PDO in the ΔarcA mutant was optimized by overexpression of PhaP, which increased more than twice the amount of the diol compared to the wild type in a semi-defined medium using glycerol, resulting in 24 g.L-1 of PDO after 48 h, with a volumetric productivity of 0.5 g.L-1h-1.
Fil: Egoburo, Diego Ezequiel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.