Mecanismos relacionados con la manifestación <i>in vitro</i> de la heteroploidía en células de mamíferos

• Autores: Pilili, Juan Pablo
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Larramendy, Marcelo Luis
• Materia: Ciencias Naturales; Células; heteroploidia; Oryctolagus cunnicules; cultivo celular; transformacion
• Institución: Universidad Nacional de La Plata

Desde el inicio de un cultivo celular, las células que lo conforman atraviesan una serie de presiones de selección donde sobrevivirán aquéllas que logren adaptarse a las condiciones desde el sistema in vivo al sistema in vitro. La mayoría de los cultivos celulares de vertebrados no progresan más allá de un número finito de divisiones y entran en senescencia replicativa. En muchas ocasiones, ya sea por inducción o espontáneamente, algunos cultivos celulares pueden adquirir una serie de características proliferativas anormales (independencia de anclaje, pérdida de inhibición de contacto, disminución de la limitación de la densidad de crecimiento, entre otras) proceso denominado transformación celular el cual a menudo se puede correlacionar con la tumorigenicidad. El objetivo general del presente plan de investigación es enunciar nuevos conocimientos en el campo de la Biología Celular y Molecular vinculados con la transformación celular in vitro acontecida en cultivos celulares provenientes de células fetales de conejo (Oryctolagus cuniculus). El cultivo inicial se originó a partir de células obtenidas de piel de la especie en cuestión mediante disgregación enzimática. La línea celular originada a partir de este cultivo se denominó JPCS1. Todos los estudios presentados en esta Tesis se realizaron cada cinco SCs (subcultivos), entre el SC 5 al SC 25 y cada diez SCs desde el SC 30 al SC 50. Para evidenciar la inestabilidad genética los estudios se realizaron tanto a nivel citogenético como molecular. A nivel citogenético se analizaron los cambios en la frecuencia del número cromosómico como así también la evolución del cariotipo de la línea celular durante su mantenimiento entre el SC 5 al 50. A nivel molecular, se utilizó como marcador de inestabilidad genética un conjunto de loci de microsatélites. Las características del control de crecimiento de la línea JPCS1 fueron evaluadas mediante el análisis de las curvas de crecimiento. En las mismas se obtuvo tanto el tiempo de duplicación poblacional media como la densidad limitante de proliferación celular. Asimismo, se realizó el estudio de curvas de crecimiento con independencia de suero donde se obtuvo la pendiente de la curva de crecimiento y la capacidad de proliferación celular en ausencia de suero. Asimismo, también fue analizado el crecimiento independiente de anclaje. Por último, la capacidad de migración celular fue investigada mediante la técnica de la herida. Los resultados de nuestras investigaciones llevados a cabo para dar cumplimiento con los objetivos de la presente Tesis Doctoral demuestran que la misma presenta inestabilidad cromosómica a partir del SC 10, previo a los cambios en los parámetros de crecimiento y migración celular, evidenciando una tendencia al aumento del número cromosómico (hiperdiploidización) cambiando el número modal desde 44 a 46 cromosomas. A partir de ganancias cromosómicas, en primera instancia por una trisomía en el cromosoma 18 a partir del SC 10 y en segunda instancia por trisomía en el cromosoma 6 a partir del SC 20 y posteriormente por tetrasomía del mismo cromosoma en el SC 40. Asimismo, la línea celular muestra un incremento en la frecuencia de la deleción de 10p -del(10)(p13)- a partir del SC 30. A nivel molecular, los resultados obtenidos demuestran que la línea JPCS1 exhibe estabilidad genética del panel de microsatélites utilizados, sin encontrarse nuevos alelos para estos marcadores ni desbalance de las variantes alélicas en los loci heterocigotas. En cuanto a los parámetros de crecimiento celular evaluados, la línea celular en cuestión presenta un acortamiento del ciclo celular demostrando un cambio abrupto entre los SCs 30 y 40, determinado por la disminución del tiempo de duplicación poblacional. Asimismo, se pudo evidenciar la existencia de una tendencia al aumento progresivo de la densidad limitante de la proliferación celular a medida que se incrementa el tiempo de cultivo, exhibiendo una disminución de la inhibición por contacto. Por otra parte, en las etapas más avanzadas del mantenimiento esta línea JPCS1 se caracteriza por exhibir crecimiento con independencia de las necesidades de factores de crecimiento, ya sea por producción autócrina o por presentar algún mecanismo de señalización intracelular alterado. La línea celular JPCS1 no demostró crecimiento con independencia de anclaje en ninguno de los SCs analizados. Por último la misma exhibió un aumento de la capacidad migratoria de las células a partir del SC 25, tendencia que se acentúa en el SC 40 demostrando una disminución de la inhibición por contacto en concordancia con los ensayos de proliferación celular. A partir de los resultados obtenidos en las investigaciones llevadas a cabo durante el desarrollo del presente trabajo de Tesis Doctoral se ha puesto en evidencia, mediante los diferentes estudios realizados que la línea celular JPCS1 originada a partir de células de embriones de Oryctolagus cuniculus luego de su mantenimiento en el sistema in vitro que el cultivo celular se encuentra transformado en el SC 40 proceso que no ha terminado, y que la inestabilidad genética a nivel cromosómico es un evento inicial del proceso de transformación.
Doctor en Ciencias Naturales
Universidad Nacional de La Plata
Facultad de Ciencias Naturales y Museo