Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR

Autores
Martínez, Silvina María
Año de publicación
2016
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
documento de conferencia
Estado
versión publicada
Descripción
Fil: Martínez, Silvina María. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura; Argentina.
INTRODUCCIÓN: La fibrosis quística (FQ) es una de las enfermedades genéticas mortales más frecuentes en la raza caucásica. Afecta a múltiples órganos y sistemas, especialmente el aparato respiratorio, el páncreas, las glándulas sudoríparas y el sistema reproductor masculino. Si bien esta enfermedad genética es causada por más de 1000 mutaciones del gen regulador de la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), existe una mutación mayoritaria, la deleción de tres pares de bases que codifican un único aminoácido (fenilalanina) en posición 508 (mutación DF508). Hasta el presente, en nuestra región, la detección de mutaciones del gen CFTR se realiza mediante PCR seguida de corrida electroforética en gel agarosa y tinción con Gel red. En búsqueda de alternativas diagnosticas se está desarrollando una técnica basada en hibridación con sondas, de la cual surge el presente trabajo consistente en la siembra de amplificados de diferentes tamaños de regiones del gen CFTR y su posterior detección con sondas específicas marcadas. -MATERIALES Y MÉTODOS: Se realizó la extracción de ADN a partir de muestras de sangre entera anticoagulada con EDTA de individuos sanos (no portadores de mutaciones causantes de fibrosis quística), previo consentimiento informado, utilizando el método con CTAB. Se amplificó el ADN extraído mediante pcr utilizando los primers obtenidos analizando la secuencia del gen normal y mutado CFTR del banco de datos de mutaciones del gen de Fibrosis Quístia. El primer par de primers permite amplificar una región de 138 pb del gen CFTR (gen normal) ó de 135 pb para el gen mutado (DF508). El segundo par de primers permite amplificar una región de 713 pb del gen CFTR (gen normal) ó de 710 pb para el gen mutado (DF508). Se sembraron en punto los amplicones obtenidos en membranas de nylon. Luego se llevó a cabo el proceso de hibridación enfrentando los amplicones sembrados a una sonda específica biotinilada a 58°C. Se lavaron las membranas y se detectó la sonda con estreptavidina conjugada con HRP. El revelado de la sonda se realizó con solución de Luminol y peróxido en la oscuridad a temperatura ambiente. Luego las membranas fueron expuestas directamente a un film RX. Se reveló el film de RX pasando sucesivamente por soluciones de revelado, lavado y fijado y se dejó secar. -RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES: Los amplicones de 138 y 713 pares de bases correspondientes al gen CFTR, resultantes de las PCR ensayadas, se corrieron en gel de agarosa al 1,5% con tinción de Gel red. Con estos se llevó a cabo la hibridación con la sonda específica. El amplicón de 713 pb dió un resultado positivo (aparición de botón negro en placa radiográfica). Al enfrentar la misma sonda al amplicón de 138 pb no se obtuvo hibridación, es decir, el resultado fue negativo (ausencia de botón negro en placa radiográfica). Estos ensayos de hibridación con ADN de individuos sanos, no portadores de gen mutado, evidencian la mayor capacidad de hibridación de la sonda con un amplicón de gran tamaño y permitiría aplicar los ensayos a muestras de ADN homocigotas (individuos enfermos) y heterocigotas (individuos portadores) para mutaciones causantes de fibrosis quística. En conclusión, los resultados obtenidos brindan información necesaria para continuar con el desarrollo de la técnica.
Materia
ADN
Gen CFTR
Fibrosis quística
Hibridación
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Repositorio
Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)
Institución
Universidad Nacional del Nordeste
OAI Identificador
oai:repositorio.unne.edu.ar:123456789/58029

id RIUNNE_8895bbc95f085baac71868d81ba28d7a
oai_identifier_str oai:repositorio.unne.edu.ar:123456789/58029
network_acronym_str RIUNNE
repository_id_str 4871
network_name_str Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)
spelling Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTRMartínez, Silvina MaríaADNGen CFTRFibrosis quísticaHibridaciónFil: Martínez, Silvina María. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura; Argentina.INTRODUCCIÓN: La fibrosis quística (FQ) es una de las enfermedades genéticas mortales más frecuentes en la raza caucásica. Afecta a múltiples órganos y sistemas, especialmente el aparato respiratorio, el páncreas, las glándulas sudoríparas y el sistema reproductor masculino. Si bien esta enfermedad genética es causada por más de 1000 mutaciones del gen regulador de la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), existe una mutación mayoritaria, la deleción de tres pares de bases que codifican un único aminoácido (fenilalanina) en posición 508 (mutación DF508). Hasta el presente, en nuestra región, la detección de mutaciones del gen CFTR se realiza mediante PCR seguida de corrida electroforética en gel agarosa y tinción con Gel red. En búsqueda de alternativas diagnosticas se está desarrollando una técnica basada en hibridación con sondas, de la cual surge el presente trabajo consistente en la siembra de amplificados de diferentes tamaños de regiones del gen CFTR y su posterior detección con sondas específicas marcadas. -MATERIALES Y MÉTODOS: Se realizó la extracción de ADN a partir de muestras de sangre entera anticoagulada con EDTA de individuos sanos (no portadores de mutaciones causantes de fibrosis quística), previo consentimiento informado, utilizando el método con CTAB. Se amplificó el ADN extraído mediante pcr utilizando los primers obtenidos analizando la secuencia del gen normal y mutado CFTR del banco de datos de mutaciones del gen de Fibrosis Quístia. El primer par de primers permite amplificar una región de 138 pb del gen CFTR (gen normal) ó de 135 pb para el gen mutado (DF508). El segundo par de primers permite amplificar una región de 713 pb del gen CFTR (gen normal) ó de 710 pb para el gen mutado (DF508). Se sembraron en punto los amplicones obtenidos en membranas de nylon. Luego se llevó a cabo el proceso de hibridación enfrentando los amplicones sembrados a una sonda específica biotinilada a 58°C. Se lavaron las membranas y se detectó la sonda con estreptavidina conjugada con HRP. El revelado de la sonda se realizó con solución de Luminol y peróxido en la oscuridad a temperatura ambiente. Luego las membranas fueron expuestas directamente a un film RX. Se reveló el film de RX pasando sucesivamente por soluciones de revelado, lavado y fijado y se dejó secar. -RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES: Los amplicones de 138 y 713 pares de bases correspondientes al gen CFTR, resultantes de las PCR ensayadas, se corrieron en gel de agarosa al 1,5% con tinción de Gel red. Con estos se llevó a cabo la hibridación con la sonda específica. El amplicón de 713 pb dió un resultado positivo (aparición de botón negro en placa radiográfica). Al enfrentar la misma sonda al amplicón de 138 pb no se obtuvo hibridación, es decir, el resultado fue negativo (ausencia de botón negro en placa radiográfica). Estos ensayos de hibridación con ADN de individuos sanos, no portadores de gen mutado, evidencian la mayor capacidad de hibridación de la sonda con un amplicón de gran tamaño y permitiría aplicar los ensayos a muestras de ADN homocigotas (individuos enfermos) y heterocigotas (individuos portadores) para mutaciones causantes de fibrosis quística. En conclusión, los resultados obtenidos brindan información necesaria para continuar con el desarrollo de la técnica.Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica2016-06-15info:eu-repo/semantics/conferenceObjectinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_5794info:ar-repo/semantics/documentoDeConferenciaapplication/pdfp. 1-1application/pdfMartínez, Silvina María, 2016. Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR. En: XXII Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Corrientes: Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica, p. 1-1.http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/58029spaUNNE/PI/PFIP 2009/AR. Corrientes/Diseño e implementación de tecnica alternativa para detección de fibrosis quística en pacientes enfermos y portadoresinfo:eu-repo/semantics/openAccesshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/Atribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Argentinareponame:Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)instname:Universidad Nacional del Nordeste2025-09-29T14:30:53Zoai:repositorio.unne.edu.ar:123456789/58029instacron:UNNEInstitucionalhttp://repositorio.unne.edu.ar/Universidad públicaNo correspondehttp://repositorio.unne.edu.ar/oaiososa@bib.unne.edu.ar;sergio.alegria@unne.edu.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:48712025-09-29 14:30:53.763Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE) - Universidad Nacional del Nordestefalse
dc.title.none.fl_str_mv Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
title Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
spellingShingle Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
Martínez, Silvina María
ADN
Gen CFTR
Fibrosis quística
Hibridación
title_short Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
title_full Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
title_fullStr Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
title_full_unstemmed Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
title_sort Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR
dc.creator.none.fl_str_mv Martínez, Silvina María
author Martínez, Silvina María
author_facet Martínez, Silvina María
author_role author
dc.subject.none.fl_str_mv ADN
Gen CFTR
Fibrosis quística
Hibridación
topic ADN
Gen CFTR
Fibrosis quística
Hibridación
dc.description.none.fl_txt_mv Fil: Martínez, Silvina María. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura; Argentina.
INTRODUCCIÓN: La fibrosis quística (FQ) es una de las enfermedades genéticas mortales más frecuentes en la raza caucásica. Afecta a múltiples órganos y sistemas, especialmente el aparato respiratorio, el páncreas, las glándulas sudoríparas y el sistema reproductor masculino. Si bien esta enfermedad genética es causada por más de 1000 mutaciones del gen regulador de la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), existe una mutación mayoritaria, la deleción de tres pares de bases que codifican un único aminoácido (fenilalanina) en posición 508 (mutación DF508). Hasta el presente, en nuestra región, la detección de mutaciones del gen CFTR se realiza mediante PCR seguida de corrida electroforética en gel agarosa y tinción con Gel red. En búsqueda de alternativas diagnosticas se está desarrollando una técnica basada en hibridación con sondas, de la cual surge el presente trabajo consistente en la siembra de amplificados de diferentes tamaños de regiones del gen CFTR y su posterior detección con sondas específicas marcadas. -MATERIALES Y MÉTODOS: Se realizó la extracción de ADN a partir de muestras de sangre entera anticoagulada con EDTA de individuos sanos (no portadores de mutaciones causantes de fibrosis quística), previo consentimiento informado, utilizando el método con CTAB. Se amplificó el ADN extraído mediante pcr utilizando los primers obtenidos analizando la secuencia del gen normal y mutado CFTR del banco de datos de mutaciones del gen de Fibrosis Quístia. El primer par de primers permite amplificar una región de 138 pb del gen CFTR (gen normal) ó de 135 pb para el gen mutado (DF508). El segundo par de primers permite amplificar una región de 713 pb del gen CFTR (gen normal) ó de 710 pb para el gen mutado (DF508). Se sembraron en punto los amplicones obtenidos en membranas de nylon. Luego se llevó a cabo el proceso de hibridación enfrentando los amplicones sembrados a una sonda específica biotinilada a 58°C. Se lavaron las membranas y se detectó la sonda con estreptavidina conjugada con HRP. El revelado de la sonda se realizó con solución de Luminol y peróxido en la oscuridad a temperatura ambiente. Luego las membranas fueron expuestas directamente a un film RX. Se reveló el film de RX pasando sucesivamente por soluciones de revelado, lavado y fijado y se dejó secar. -RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES: Los amplicones de 138 y 713 pares de bases correspondientes al gen CFTR, resultantes de las PCR ensayadas, se corrieron en gel de agarosa al 1,5% con tinción de Gel red. Con estos se llevó a cabo la hibridación con la sonda específica. El amplicón de 713 pb dió un resultado positivo (aparición de botón negro en placa radiográfica). Al enfrentar la misma sonda al amplicón de 138 pb no se obtuvo hibridación, es decir, el resultado fue negativo (ausencia de botón negro en placa radiográfica). Estos ensayos de hibridación con ADN de individuos sanos, no portadores de gen mutado, evidencian la mayor capacidad de hibridación de la sonda con un amplicón de gran tamaño y permitiría aplicar los ensayos a muestras de ADN homocigotas (individuos enfermos) y heterocigotas (individuos portadores) para mutaciones causantes de fibrosis quística. En conclusión, los resultados obtenidos brindan información necesaria para continuar con el desarrollo de la técnica.
description Fil: Martínez, Silvina María. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura; Argentina.
publishDate 2016
dc.date.none.fl_str_mv 2016-06-15
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/conferenceObject
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
http://purl.org/coar/resource_type/c_5794
info:ar-repo/semantics/documentoDeConferencia
format conferenceObject
status_str publishedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv Martínez, Silvina María, 2016. Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR. En: XXII Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Corrientes: Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica, p. 1-1.
http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/58029
identifier_str_mv Martínez, Silvina María, 2016. Diferencia en la capacidad de hibridación de amplificados del gen CFTR. En: XXII Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Corrientes: Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica, p. 1-1.
url http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/58029
dc.language.none.fl_str_mv spa
language spa
dc.relation.none.fl_str_mv UNNE/PI/PFIP 2009/AR. Corrientes/Diseño e implementación de tecnica alternativa para detección de fibrosis quística en pacientes enfermos y portadores
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Atribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Argentina
eu_rights_str_mv openAccess
rights_invalid_str_mv http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Atribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Argentina
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
p. 1-1
application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica
publisher.none.fl_str_mv Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)
instname:Universidad Nacional del Nordeste
reponame_str Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)
collection Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)
instname_str Universidad Nacional del Nordeste
repository.name.fl_str_mv Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE) - Universidad Nacional del Nordeste
repository.mail.fl_str_mv ososa@bib.unne.edu.ar;sergio.alegria@unne.edu.ar
_version_ 1844621699577806848
score 12.559606