Efecto de la edad y categoría reproductiva de la yegua sobre el estado de desarrollo y viabilidad in vitro de embriones tempranos
- Autores
- Marinone, Ana Inés
- Año de publicación
- 2016
- Idioma
- español castellano
- Tipo de recurso
- tesis doctoral
- Estado
- versión aceptada
- Colaborador/a o director/a de tesis
- Fumuso, Elida
Losinno, Luis - Descripción
- En las últimas dos décadas, Argentina se ha destacado en la producción de embriones equinos ubicándose como el segundo productor mundial, luego de Brasil. La eficiencia productiva global en los sistemas comerciales de TE es aproximadamente del 35%. Esta baja eficiencia puede estar relacionada al hecho de que, en equinos, los animales son seleccionados por su desempeño deportivo sin tener en cuenta su aptitud reproductiva. Además, las yeguas obtienen su mayor valor económico cuando suman, a su genealogía, sus propios índices productivos y los de su progenie, lo cual ocurre pasada la mitad de su vida media reproductiva y coincide con una disminución en los índices de fertilidad. Esto ocasiona que dentro de los sistemas productivos existan animales subfértiles. Esta tesis consta de dos Capítulos. El Capítulo I corresponde a un estudio retrospectivo realizado a partir de la base de datos de un programa comercial a gran escala ubicado en la provincia de Buenos Aires, cuyos objetivos fueron evaluar el efecto de la edad de la yegua donante sobre variables reproductivas específicas en un sistema comercial de TE y detectar el porcentaje de yeguas subfértiles en cada categoría. El capítulo II corresponde a un estudio realizado en un haras ubicado en Tandil, provincia de Buenos Aires. Los objetivos fueron comparar variables reproductivas y viabilidad de embriones producidos in vivo, en yeguas viejas y jóvenes sub-fértiles. En este capítulo se investigan las diferencias y similitudes que existen entre yeguas viejas (en las cuales el envejecimiento ha producido cambios deletéreos en su organismo y por consiguiente en la reproducción) y yeguas jóvenes subfértiles (en las cuales se desconoce la causa de dicha subfertilidad). En el capítulo I las donantes fueron clasificadas en 3 grupos: Potrancas (3 y 4 años), Yeguas de mediana edad (5 a 10 años) y Viejas (13 a 25 años). Las variables estudiadas fueron tasa de recuperación de embriones (RE), tasa de ovulación múltiple (OM), tasa de preñez post-transferencia (PR) y duración en días de intervalos interovulatorios (IOI). En el capítulo II las yeguas fueron clasificadas en 2 grupos: Yeguas jóvenes subfértiles (3 a 10 años) y yeguas viejas (14 a 26 años). Las variables estudiadas fueron RE, OM, duración de los IOI, concentraciones plasmáticas de progesterona al día 8 post-ovulación, contaminación de efluentes uterinos, patrones de inflamación en endometrio, receptores nucleares de progesterona en endometrio, grado de desarrollo y expresión de genes de estrés de los embriones recuperados. Los resultados del capítulo I demostraron que en un programa comercial de 8 transferencia embrionaria a gran escala, la edad de la yegua donante afecta la RE, la incidencia de MO y la duración de los IOI, pero no el PR después de la transferencia. También se comprobó que la longitud IOI influye en el resultado del lavaje posterior, y que existen yeguas subfértiles dentro de las 3 categorías estudiadas, sin embargo en el grupo de yeguas viejas el porcentaje de estas yeguas duplica al porcentaje hallado en los otros dos grupos. En el capítulo II los resultados permiten concluir que las yeguas jóvenes subfértiles presentan menor duración de los IOI y menor susceptibilidad a contraer endometritis bacteriana. Con respecto a las concentraciones de progesterona plasmática al día 8 postovulación, la RE, la ocurrencia de OM, el estadio de desarrollo de los embriones recuperados en los días estudiados y el nivel de estrés al cual están expuestos los embriones, se hallaron resultados similares para los dos grupos de estudio. En cuanto a los patrones de inflamación en endometrio se hallaron diferencias entre los dos grupos, encontrándose células indicadoras de inflamación crónica en las yeguas viejas. Además, se observó que si bien la cantidad de receptores de progesterona en el endometrio y su inmunoreactividad al día 8 post- ovulación es similar en yeguas viejas y jóvenes subfértiles, en las yeguas viejas existe un patrón de distribución diferente, encontrándose la mayor cantidad de receptores de progesterona y con mayor inmunoreactividad en el epitelio luminal. Finalmente concluimos que las Yeguas Subfértiles comparten varias condiciones reproductivas patológicas con las yeguas viejas, que hasta el momento, debido a las características de los diseños experimentales previos a este trabajo, no habían sido consideradas como objeto de estudio.
Fil: Marinone, Ana Inés. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Fumuso, Elida. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Losinno, Luis. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
The equine embryo production in Argentina has been increased in the last two decades, placing this country as the second largest producer, behind Brazil. Overall efficiency of these systems is approximately 35%. This low efficiency may be related to the fact that, in horses, animals are selected by their sports career and the expected performance of their offspring, regardless of their fertility. In addition, mares get their higher economic value due to their sport performance and the performance of their offspring. This occurs after the middle of its reproductive average life and coincides with a decrease in fertility rates. Both are causes of that subfertile animals are included in commercial programs. This thesis has two chapters. Chapter I is a retrospective field study from the data of a commercial Equine Embryo transfer (EET) center in Buenos Aires. The aim of this study was to evaluate the effect of donor’s age on several reproductive parameters and identify the amount of subfertile animals in each category. Chapter II is a field study in a farm located in Tandil, Buenos Aires province. The aim of this study was to compare several reproductive parameters and embryo viability between old mares and young subfertile mares. In this chapter, differences and similarities between old mares (in which the aging process has produced changes in reproduction) and young subfertile mares (whose cause of subfertility is unknown) are investigated. In chapter I, donors were classified into 3 age groups: Fillies (3 and 4 years old), Middle age (5 to 10 years old) and Old (13 to 25 years old). Embryo recovery (ERR), multiple ovulation (MO), pregnancy rates (PR) and interovulatory intervals (IOI) were compared. In chapter II, mares were classified in two groups: Young subfertile (3 to 10 years old) and Old (14 to 26 years old). ERR, MO, IOI, progesterone plasma concentrations on day 8 post-ovulation, uterine effluent contamination, endometrial inflammation patterns, endometrial nuclear progesterone receptors, embryo development and embryo stress gene expression were compared. From chapter I, it can be concluded that in a large scale EET commercial program, the age of the donor mare affected ERR, the incidence of MO and the IOI, but not the post-transfer PR. Furthermore, the IOI length influenced the outcome of the subsequent flushing, and that there are subfertile mares in the three studied groups, however in the old group the percentage of subfertile mares is two times higher than in the others groups. From chapter II, it can be concluded that IOI and bacterial endometritis susceptibility is lower in young subfertile mares. Plasma 10 progesterone concentrations, ERR, MO, embryo development and embryo stress gene expression were similar in both groups. Endometrial inflammation patterns were different between young subfertile and old mares; chronic inflammation cells in the old group were detected. No differences were found in the amount of endometrial progesterone receptors in the two studied groups. However a different distribution pattern was found; where higher amount of receptors was detected in the luminal epithelium of endometrial samples from old mares. Finally we concluded that young subfertile mares share several pathologic conditions with old mares, and this was not considered previously in an experimental design. - Materia
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- Repositorio
- Institución
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Esto ocasiona que dentro de los sistemas productivos existan animales subfértiles. Esta tesis consta de dos Capítulos. El Capítulo I corresponde a un estudio retrospectivo realizado a partir de la base de datos de un programa comercial a gran escala ubicado en la provincia de Buenos Aires, cuyos objetivos fueron evaluar el efecto de la edad de la yegua donante sobre variables reproductivas específicas en un sistema comercial de TE y detectar el porcentaje de yeguas subfértiles en cada categoría. El capítulo II corresponde a un estudio realizado en un haras ubicado en Tandil, provincia de Buenos Aires. Los objetivos fueron comparar variables reproductivas y viabilidad de embriones producidos in vivo, en yeguas viejas y jóvenes sub-fértiles. En este capítulo se investigan las diferencias y similitudes que existen entre yeguas viejas (en las cuales el envejecimiento ha producido cambios deletéreos en su organismo y por consiguiente en la reproducción) y yeguas jóvenes subfértiles (en las cuales se desconoce la causa de dicha subfertilidad). En el capítulo I las donantes fueron clasificadas en 3 grupos: Potrancas (3 y 4 años), Yeguas de mediana edad (5 a 10 años) y Viejas (13 a 25 años). Las variables estudiadas fueron tasa de recuperación de embriones (RE), tasa de ovulación múltiple (OM), tasa de preñez post-transferencia (PR) y duración en días de intervalos interovulatorios (IOI). En el capítulo II las yeguas fueron clasificadas en 2 grupos: Yeguas jóvenes subfértiles (3 a 10 años) y yeguas viejas (14 a 26 años). Las variables estudiadas fueron RE, OM, duración de los IOI, concentraciones plasmáticas de progesterona al día 8 post-ovulación, contaminación de efluentes uterinos, patrones de inflamación en endometrio, receptores nucleares de progesterona en endometrio, grado de desarrollo y expresión de genes de estrés de los embriones recuperados. Los resultados del capítulo I demostraron que en un programa comercial de 8 transferencia embrionaria a gran escala, la edad de la yegua donante afecta la RE, la incidencia de MO y la duración de los IOI, pero no el PR después de la transferencia. También se comprobó que la longitud IOI influye en el resultado del lavaje posterior, y que existen yeguas subfértiles dentro de las 3 categorías estudiadas, sin embargo en el grupo de yeguas viejas el porcentaje de estas yeguas duplica al porcentaje hallado en los otros dos grupos. En el capítulo II los resultados permiten concluir que las yeguas jóvenes subfértiles presentan menor duración de los IOI y menor susceptibilidad a contraer endometritis bacteriana. Con respecto a las concentraciones de progesterona plasmática al día 8 postovulación, la RE, la ocurrencia de OM, el estadio de desarrollo de los embriones recuperados en los días estudiados y el nivel de estrés al cual están expuestos los embriones, se hallaron resultados similares para los dos grupos de estudio. En cuanto a los patrones de inflamación en endometrio se hallaron diferencias entre los dos grupos, encontrándose células indicadoras de inflamación crónica en las yeguas viejas. Además, se observó que si bien la cantidad de receptores de progesterona en el endometrio y su inmunoreactividad al día 8 post- ovulación es similar en yeguas viejas y jóvenes subfértiles, en las yeguas viejas existe un patrón de distribución diferente, encontrándose la mayor cantidad de receptores de progesterona y con mayor inmunoreactividad en el epitelio luminal. Finalmente concluimos que las Yeguas Subfértiles comparten varias condiciones reproductivas patológicas con las yeguas viejas, que hasta el momento, debido a las características de los diseños experimentales previos a este trabajo, no habían sido consideradas como objeto de estudio.Fil: Marinone, Ana Inés. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.Fil: Fumuso, Elida. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.Fil: Losinno, Luis. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.The equine embryo production in Argentina has been increased in the last two decades, placing this country as the second largest producer, behind Brazil. Overall efficiency of these systems is approximately 35%. This low efficiency may be related to the fact that, in horses, animals are selected by their sports career and the expected performance of their offspring, regardless of their fertility. In addition, mares get their higher economic value due to their sport performance and the performance of their offspring. This occurs after the middle of its reproductive average life and coincides with a decrease in fertility rates. Both are causes of that subfertile animals are included in commercial programs. This thesis has two chapters. Chapter I is a retrospective field study from the data of a commercial Equine Embryo transfer (EET) center in Buenos Aires. The aim of this study was to evaluate the effect of donor’s age on several reproductive parameters and identify the amount of subfertile animals in each category. Chapter II is a field study in a farm located in Tandil, Buenos Aires province. The aim of this study was to compare several reproductive parameters and embryo viability between old mares and young subfertile mares. In this chapter, differences and similarities between old mares (in which the aging process has produced changes in reproduction) and young subfertile mares (whose cause of subfertility is unknown) are investigated. In chapter I, donors were classified into 3 age groups: Fillies (3 and 4 years old), Middle age (5 to 10 years old) and Old (13 to 25 years old). Embryo recovery (ERR), multiple ovulation (MO), pregnancy rates (PR) and interovulatory intervals (IOI) were compared. In chapter II, mares were classified in two groups: Young subfertile (3 to 10 years old) and Old (14 to 26 years old). 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Endometrial inflammation patterns were different between young subfertile and old mares; chronic inflammation cells in the old group were detected. No differences were found in the amount of endometrial progesterone receptors in the two studied groups. However a different distribution pattern was found; where higher amount of receptors was detected in the luminal epithelium of endometrial samples from old mares. Finally we concluded that young subfertile mares share several pathologic conditions with old mares, and this was not considered previously in an experimental design.Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. 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En las últimas dos décadas, Argentina se ha destacado en la producción de embriones equinos ubicándose como el segundo productor mundial, luego de Brasil. La eficiencia productiva global en los sistemas comerciales de TE es aproximadamente del 35%. Esta baja eficiencia puede estar relacionada al hecho de que, en equinos, los animales son seleccionados por su desempeño deportivo sin tener en cuenta su aptitud reproductiva. Además, las yeguas obtienen su mayor valor económico cuando suman, a su genealogía, sus propios índices productivos y los de su progenie, lo cual ocurre pasada la mitad de su vida media reproductiva y coincide con una disminución en los índices de fertilidad. Esto ocasiona que dentro de los sistemas productivos existan animales subfértiles. Esta tesis consta de dos Capítulos. El Capítulo I corresponde a un estudio retrospectivo realizado a partir de la base de datos de un programa comercial a gran escala ubicado en la provincia de Buenos Aires, cuyos objetivos fueron evaluar el efecto de la edad de la yegua donante sobre variables reproductivas específicas en un sistema comercial de TE y detectar el porcentaje de yeguas subfértiles en cada categoría. El capítulo II corresponde a un estudio realizado en un haras ubicado en Tandil, provincia de Buenos Aires. Los objetivos fueron comparar variables reproductivas y viabilidad de embriones producidos in vivo, en yeguas viejas y jóvenes sub-fértiles. En este capítulo se investigan las diferencias y similitudes que existen entre yeguas viejas (en las cuales el envejecimiento ha producido cambios deletéreos en su organismo y por consiguiente en la reproducción) y yeguas jóvenes subfértiles (en las cuales se desconoce la causa de dicha subfertilidad). En el capítulo I las donantes fueron clasificadas en 3 grupos: Potrancas (3 y 4 años), Yeguas de mediana edad (5 a 10 años) y Viejas (13 a 25 años). Las variables estudiadas fueron tasa de recuperación de embriones (RE), tasa de ovulación múltiple (OM), tasa de preñez post-transferencia (PR) y duración en días de intervalos interovulatorios (IOI). En el capítulo II las yeguas fueron clasificadas en 2 grupos: Yeguas jóvenes subfértiles (3 a 10 años) y yeguas viejas (14 a 26 años). Las variables estudiadas fueron RE, OM, duración de los IOI, concentraciones plasmáticas de progesterona al día 8 post-ovulación, contaminación de efluentes uterinos, patrones de inflamación en endometrio, receptores nucleares de progesterona en endometrio, grado de desarrollo y expresión de genes de estrés de los embriones recuperados. Los resultados del capítulo I demostraron que en un programa comercial de 8 transferencia embrionaria a gran escala, la edad de la yegua donante afecta la RE, la incidencia de MO y la duración de los IOI, pero no el PR después de la transferencia. También se comprobó que la longitud IOI influye en el resultado del lavaje posterior, y que existen yeguas subfértiles dentro de las 3 categorías estudiadas, sin embargo en el grupo de yeguas viejas el porcentaje de estas yeguas duplica al porcentaje hallado en los otros dos grupos. En el capítulo II los resultados permiten concluir que las yeguas jóvenes subfértiles presentan menor duración de los IOI y menor susceptibilidad a contraer endometritis bacteriana. Con respecto a las concentraciones de progesterona plasmática al día 8 postovulación, la RE, la ocurrencia de OM, el estadio de desarrollo de los embriones recuperados en los días estudiados y el nivel de estrés al cual están expuestos los embriones, se hallaron resultados similares para los dos grupos de estudio. En cuanto a los patrones de inflamación en endometrio se hallaron diferencias entre los dos grupos, encontrándose células indicadoras de inflamación crónica en las yeguas viejas. Además, se observó que si bien la cantidad de receptores de progesterona en el endometrio y su inmunoreactividad al día 8 post- ovulación es similar en yeguas viejas y jóvenes subfértiles, en las yeguas viejas existe un patrón de distribución diferente, encontrándose la mayor cantidad de receptores de progesterona y con mayor inmunoreactividad en el epitelio luminal. Finalmente concluimos que las Yeguas Subfértiles comparten varias condiciones reproductivas patológicas con las yeguas viejas, que hasta el momento, debido a las características de los diseños experimentales previos a este trabajo, no habían sido consideradas como objeto de estudio. Fil: Marinone, Ana Inés. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Fumuso, Elida. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Losinno, Luis. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. The equine embryo production in Argentina has been increased in the last two decades, placing this country as the second largest producer, behind Brazil. Overall efficiency of these systems is approximately 35%. This low efficiency may be related to the fact that, in horses, animals are selected by their sports career and the expected performance of their offspring, regardless of their fertility. In addition, mares get their higher economic value due to their sport performance and the performance of their offspring. This occurs after the middle of its reproductive average life and coincides with a decrease in fertility rates. Both are causes of that subfertile animals are included in commercial programs. This thesis has two chapters. Chapter I is a retrospective field study from the data of a commercial Equine Embryo transfer (EET) center in Buenos Aires. The aim of this study was to evaluate the effect of donor’s age on several reproductive parameters and identify the amount of subfertile animals in each category. Chapter II is a field study in a farm located in Tandil, Buenos Aires province. The aim of this study was to compare several reproductive parameters and embryo viability between old mares and young subfertile mares. In this chapter, differences and similarities between old mares (in which the aging process has produced changes in reproduction) and young subfertile mares (whose cause of subfertility is unknown) are investigated. In chapter I, donors were classified into 3 age groups: Fillies (3 and 4 years old), Middle age (5 to 10 years old) and Old (13 to 25 years old). Embryo recovery (ERR), multiple ovulation (MO), pregnancy rates (PR) and interovulatory intervals (IOI) were compared. In chapter II, mares were classified in two groups: Young subfertile (3 to 10 years old) and Old (14 to 26 years old). ERR, MO, IOI, progesterone plasma concentrations on day 8 post-ovulation, uterine effluent contamination, endometrial inflammation patterns, endometrial nuclear progesterone receptors, embryo development and embryo stress gene expression were compared. From chapter I, it can be concluded that in a large scale EET commercial program, the age of the donor mare affected ERR, the incidence of MO and the IOI, but not the post-transfer PR. Furthermore, the IOI length influenced the outcome of the subsequent flushing, and that there are subfertile mares in the three studied groups, however in the old group the percentage of subfertile mares is two times higher than in the others groups. From chapter II, it can be concluded that IOI and bacterial endometritis susceptibility is lower in young subfertile mares. Plasma 10 progesterone concentrations, ERR, MO, embryo development and embryo stress gene expression were similar in both groups. Endometrial inflammation patterns were different between young subfertile and old mares; chronic inflammation cells in the old group were detected. No differences were found in the amount of endometrial progesterone receptors in the two studied groups. However a different distribution pattern was found; where higher amount of receptors was detected in the luminal epithelium of endometrial samples from old mares. Finally we concluded that young subfertile mares share several pathologic conditions with old mares, and this was not considered previously in an experimental design. |
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En las últimas dos décadas, Argentina se ha destacado en la producción de embriones equinos ubicándose como el segundo productor mundial, luego de Brasil. La eficiencia productiva global en los sistemas comerciales de TE es aproximadamente del 35%. Esta baja eficiencia puede estar relacionada al hecho de que, en equinos, los animales son seleccionados por su desempeño deportivo sin tener en cuenta su aptitud reproductiva. Además, las yeguas obtienen su mayor valor económico cuando suman, a su genealogía, sus propios índices productivos y los de su progenie, lo cual ocurre pasada la mitad de su vida media reproductiva y coincide con una disminución en los índices de fertilidad. Esto ocasiona que dentro de los sistemas productivos existan animales subfértiles. Esta tesis consta de dos Capítulos. El Capítulo I corresponde a un estudio retrospectivo realizado a partir de la base de datos de un programa comercial a gran escala ubicado en la provincia de Buenos Aires, cuyos objetivos fueron evaluar el efecto de la edad de la yegua donante sobre variables reproductivas específicas en un sistema comercial de TE y detectar el porcentaje de yeguas subfértiles en cada categoría. El capítulo II corresponde a un estudio realizado en un haras ubicado en Tandil, provincia de Buenos Aires. Los objetivos fueron comparar variables reproductivas y viabilidad de embriones producidos in vivo, en yeguas viejas y jóvenes sub-fértiles. En este capítulo se investigan las diferencias y similitudes que existen entre yeguas viejas (en las cuales el envejecimiento ha producido cambios deletéreos en su organismo y por consiguiente en la reproducción) y yeguas jóvenes subfértiles (en las cuales se desconoce la causa de dicha subfertilidad). En el capítulo I las donantes fueron clasificadas en 3 grupos: Potrancas (3 y 4 años), Yeguas de mediana edad (5 a 10 años) y Viejas (13 a 25 años). Las variables estudiadas fueron tasa de recuperación de embriones (RE), tasa de ovulación múltiple (OM), tasa de preñez post-transferencia (PR) y duración en días de intervalos interovulatorios (IOI). En el capítulo II las yeguas fueron clasificadas en 2 grupos: Yeguas jóvenes subfértiles (3 a 10 años) y yeguas viejas (14 a 26 años). Las variables estudiadas fueron RE, OM, duración de los IOI, concentraciones plasmáticas de progesterona al día 8 post-ovulación, contaminación de efluentes uterinos, patrones de inflamación en endometrio, receptores nucleares de progesterona en endometrio, grado de desarrollo y expresión de genes de estrés de los embriones recuperados. Los resultados del capítulo I demostraron que en un programa comercial de 8 transferencia embrionaria a gran escala, la edad de la yegua donante afecta la RE, la incidencia de MO y la duración de los IOI, pero no el PR después de la transferencia. También se comprobó que la longitud IOI influye en el resultado del lavaje posterior, y que existen yeguas subfértiles dentro de las 3 categorías estudiadas, sin embargo en el grupo de yeguas viejas el porcentaje de estas yeguas duplica al porcentaje hallado en los otros dos grupos. En el capítulo II los resultados permiten concluir que las yeguas jóvenes subfértiles presentan menor duración de los IOI y menor susceptibilidad a contraer endometritis bacteriana. Con respecto a las concentraciones de progesterona plasmática al día 8 postovulación, la RE, la ocurrencia de OM, el estadio de desarrollo de los embriones recuperados en los días estudiados y el nivel de estrés al cual están expuestos los embriones, se hallaron resultados similares para los dos grupos de estudio. En cuanto a los patrones de inflamación en endometrio se hallaron diferencias entre los dos grupos, encontrándose células indicadoras de inflamación crónica en las yeguas viejas. Además, se observó que si bien la cantidad de receptores de progesterona en el endometrio y su inmunoreactividad al día 8 post- ovulación es similar en yeguas viejas y jóvenes subfértiles, en las yeguas viejas existe un patrón de distribución diferente, encontrándose la mayor cantidad de receptores de progesterona y con mayor inmunoreactividad en el epitelio luminal. Finalmente concluimos que las Yeguas Subfértiles comparten varias condiciones reproductivas patológicas con las yeguas viejas, que hasta el momento, debido a las características de los diseños experimentales previos a este trabajo, no habían sido consideradas como objeto de estudio. |
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