Estabilidad térmica de proteínas inducida por ligandos : caracterización de subestados conformacionales en proteínas

• Autores: Celej, María Soledad
• Año de publicación: 2004
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fidelio, Gerardo Daniel; Maggio, Bruno; Beaugé, Luis Alberto; Ortiz, Cristina Susana
• Materia: Proteínas; Albumina sérica humana; Ligandos
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Dr. en Ciencias Químicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2004.
Fil: Celej, María Soledad. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Celej, María Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Este trabajo de tesis está orientado a conocer las bases termodinámicas y estructurales por las cuales ligandos de diferente afinidad modifican la estabilidad térmica de proteínas. Las modificaciones en la termoestabilidad de la proteína fueron estudiadas mediante calorimetría diferencial de barrido y fueron racionalizadas utilizando un modelo basado en equilibrios químicos acoplados. En este modelo, el equilibrio establecido entre los estados nativo y desnaturalizado de la proteína se encuentra acoplado a equilibrios de asociación de ligando a cualquiera de dichos estados. Utilizando el marco termodinámico de este modelo, se desarrolló un programa que permite simular los perfiles de capacidad calorífica versus temperatura (termogramas) de proteínas en ausencia y en presencia de distintas concentraciones de ligando. En primer lugar, reali7amos un exhaustivo análisis teórico de la influencia de los distintos parámetros fisicoquímicos que caracterizan la interacción ligando:proteína en la termoestabifidad de la macromolécula. Este análisis evidenció la complejidad del sistema, mostrando que el número de sitios de asociación del ligando, el modelo de interacción, la magnitud y dependencia con la temperatura de las constantes de asociación son responsables, en conjunto, de los cambios en la termoestabifidad. El estudio experimental fue abordado estudiando el impacto de la presencia de distintos derivados de la sonda fluorescente aniiinonaftalenosulfonato sobre la estabilidad de albúmina sérica humana y bovina. El análisis teórico basado en el modelo anteriormente mencionado, nos permitió explicar los resultados experimentales obtenidos. En adición, el programa desarrollado fue acoplado a rutinas de optimización multidimensional a fin de obtener los parámetros termodinámicos de interacción ligando:proteína a partir de termogramas obtenidos en presencia de distintas cantidades de ligando, ampliando las posibffidades operativas del calorímetro diferencial de barrido. El segundo aspecto importante de esta tesis se relaciona con el estudio de cambios en la estructura y/o flexibilidad conformacional de la proteína cuando interacciona con el ligando. Para cumplir con este objetivo utilizamos distintas técnicas espectroscópicas como dicroísmo circular, fluorescencia e infrarrojo a fin de obtener información de la estructura secundaria y terciaria de proteínas. Además, se puso a punto la técnica de intercambio H/D monitoreada por infrarrojo para evidenciar los cambios en la flexibilidad conformacional. Empleamos como sistemas experimentales a los derivados de la sonda fluorescente anilinonaftalenosulfonato interaccionando con albúmina sérica bovina. Los estudios estructurales de los complejos formados mostraron que el incremento de la estabilidad térmica correlaciona con la disminución de la flexibilidad conformacional de la proteína. La comparación con los resultados obtenidos para el complejo formado entre biotina y la proteína avidina señalaron que esta correlación entre termoestabilidad y flexibilidad conformacional es independiente del tipo de estructura secundaria de la proteína. Los cambios estructurales fueron interpretados en base al desplazamiento de equilibrios entre los distintos confórmeros que forman un dado estado macroscópico de la proteína. En este sentido, hemos caracterizado diferentes confórmeros distinguibles por sus estabilidades térmicas y características estructurales. Finalmente, nos interesamos en el estudio de la estabilidad de proteínas ancladas a través de un puente de ligando. Para ello trabajamos con un sistema de interés biotecnológico el cual hace uso de la alta constante de asociación entre biotina y la proteína streptavidina aun cuando la vitamina se encuentra unida covalentemente a otras biomoléculas. El resultado más remarcable es que la estabilidad de streptavidina incrementa ya sea que el ligando se encuentre libre o acoplado a otra macromolécula en su estado nativo o desnaturalizado.
Fil: Celej, María Soledad. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Celej, María Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.