Bases estructurales de la termoestabilidad de βgalactosidasa en sistemas heterogéneos

• Autores: Flores, Sandra Soledad
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Sánchez, Julieta Ma.; Nolan, Ma. Verónica
• Materia: His-tag; Lactosa; Biología; NATURAL SCIENCES
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Fil: Flores, Sandra Soledad. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Doctorado en Ciencias Biológicas; Argentina.
La lactasa o β-galactosidasa (β-Gal) (EC. 3.2.1.23) es una enzima ampliamente utilizada y de gran interés en la industria láctea, en farmacología y biología molecular. Esta enzima cataliza la hidrólisis de un enlace β-galactosídico terminal presente en carbohidratos, glicolípidos, glicoproteínas y glicosaminoglicanos, siendo el sustrato natural más conocido la lactosa o azúcar de la leche. La β-Gal se encuentra distribuida tanto en plantas, animales, hongos y bacterias. La actividad de β-Gal soluble suele medirse en sistemas heterogéneos tales como sangre, leche y muestras fermentadas o en presencia de detergentes que se utilizan a los fines de liberar la enzima del microorganismo a partir del cual es purificada. Tanto la actividad como la estructura de la enzima pueden verse afectadas por la presencia de estos sistemas complejos. Los objetivos de este trabajo de Tesis fueron estudiar la actividad de distintas β-Gals tanto en solución como en sistemas heterogéneos y correlacionar dicha actividad con posibles cambios en la estructura de la enzima, principalmente en cambios en la termoestabilidad de las enzimas. Se utilizaron dos enzimas: β-Gal de Escherichia coli de origen comercial (β-GalWT) y una forma recombinante producida en nuestro laboratorio (β-GalHis), que tiene la particularidad de tener un hexapéptido de histidina del lado C-terminal de cada monómero. Distintos sistemas experimentales se utilizaron para simular sistemas heterogéneos como vesículas multilamelares lipídicas y cuerpos de inclusión. La actividad de las enzimas se ensayó frente al sustrato natural lactosa. En primera instancia se caracterizó a las enzimas utilizadas, encontrándose que la forma recombinante presenta menor actividad que la forma salvaje: esto podría correlacionarse con los cambios estructurales encontrados para β-GalHis: menor capacidad de tetramerización (el tetrámero es la forma activa de la enzima), un espectro de fluorescencia con corrimiento hacia mayor longitud de onda y un espectro de absorción en el infrarrojo que muestra pérdida de la estructura nativa. Todos estos cambios podrían explicar la disminución de actividad observada. Por otro lado, la proteína recombinante mostró ser levemente más termoestable que la forma nativa. El estudio de las enzimas en sistemas heterogéneos mostró que ambas enzimas son más activas en presencia de interfases neutras. La βGalHis no mostró activación por interfases negativas, contrariamente a lo esperado ya que debido a las histidinas adicionales la proteína tendría cierta carga adicional que favorecería su interacción con interfases cargadas negativamente. Por otro lado, β-GalHis incorporada en cuerpos de inclusión también mostró ser más activa que la contraparte soluble. En ambos casos se encontró que la enzima en sistemas heterogéneos es más termoestable que en solución; esta termoestabilización podría ser debida a que la proteína se encuentra en estados de oligomerización superiores ya sea debido a que esté formando parte de cuerpos de inclusión o debido a la adquisición de un nuevo estado oligomérico cuando se encuentra adsorbida en interfases. Estudios de espectroscopía de infrarrojo mostraron que, en estas condiciones, la estructura de la proteína se modifica aumentando el contenido de estructura β-intermolecular, lo cual sería un indicio de que se encontraría en estados de oligomerización superiores. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis enfocados al análisis de la termoestabilidad de β-GalHis recombinante en ambientes heterogéneos aportan más evidencias a la adquisición de termoestabilidad debido a la autoagregación.
Fil: Flores, Sandra Soledad. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Doctorado en Ciencias Biológicas; Argentina.