Caracterización de glicolipido glicosiltransferasas en la superficie celular

• Autores: Torres Demichelis, Vanina Andrea
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Daniotti, José Luis; Perillo, María Angelica; Nores, Gustavo Alejandro; D'Alessio, Cecilia; Alvarez, Cecilia Inés
• Materia: Gangliosidos; Glicosiltransferasas; Glicoproteinas; Aparato de Golgi
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctor en Ciencia Químicas) – Universidad Nacional de Córdoba, 2013.
Fil: Torres Demichelis, Vanina Andrea. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Capítulo 1 Los gangliósidos, glicolípidos que contienen una o más unidades de ácido siálico, son sintetizados en membranas del retículo endoplásmico y del complejo de Golgi. Una vez sintetizados, son transportados en vesículas hacia la membrana plasmática formando parte de los constituyentes de la hemicapa externa de la misma. Los gangliósidos pueden ser internalizados, mediante diferentes vías endocíticas, y luego reciclar hacia la superficie celular, o ser conducidos hacia el complejo de Golgi o lisosomas para ser modificados o catabolizados, respectivamente. Recientemente se ha descripto la presencia de enzimas que catabolizan glicolípidos (glicohidrolasas) asociadas a la membrana plasmática, donde ejercen su actividad enzimática sobre componentes de la misma. En el primer capítulo de este trabajo de Tesis, demostramos que ecto-gangliósido glicosíltransferasas pueden catalizar la síntesis de gangliósidos fuera del complejo de Golgi, particularmente en la superficie celular. Específicamente, aportamos evidencias directas de la expresión y actividad de la enzima CMP-NeuAc: GM3 sial íltra nsferasa (Sial-T2) en la membrana plasmática de células epiteliales. Los resultados demuestran que la enzima ecto-Sial-T2 (Sial-T2 presente en la superficie celular) es capaz de catalizar la unión de ácido siálico al sustrato aceptor endógeno (GM3) como así también al GM3 incorporado de manera exógena. Por otra parte, demostramos que ecto-Sial-T2 es capaz de sintetizar el gangliósido GD3 en la superficie celular utilizando el sustrato donor citidina monofosfato-ácido siálico (CMP-NeuAc), disponible en el espacio extracelular. Además, mediante técnicas bioquímicas y de biología celular detectamos la expresión de la enzima UDP- GaINAc: LacCer/GM3/GD3 N-acetilga lactosaminiltransferasa (GaINAc-T) en la membrana plasmática de células epiteliales, cuya actividad catalítica fue puesta de manifiesto luego de incubar a las células con sustrato GM3 exógeno. De esta manera, el balance de actividades enzimáticas de glicosíltransferasas y glicohidrolasas asociadas a membrana plasmática, actuando sobre un sustrato común, podría postularse como un potencial nivel de regulación de la composición local de glicolípidos en respuesta a diferentes estímulos internos y externos. 3 RESUMEN Capítulo II Los resultados bioquímicos descriptos en el resumen del capítulo anterior demuestran que Sial-T2 es capaz de sintetizar el gangliósido GD3 a partir de GM3 en la superficie celular (actividad cis-catalítica). En el segundo capítulo de esta tesis se demuestra que la ecto-Sial-T2 asociada a la membrana plasmática también muestra una actividad trans-catalítica en células epiteliales y de melanoma. Mediante el uso de ensayos de ELISA, combinado con microscopía de fluorescencia confocal, se observó que ecto-Sial-T2 fue capaz de sialidar el gangliósido GM3 adsorbido o inmovilizado covalentemente sobre una superficie sólida. Además, se observó que ecto-Sial-T2 fue capaz de sialidar el gangliósido GM3 expuesto en la membrana de las células vecinas usando tanto el sustrato donar (CMP-NeuAc) exógeno como el endógeno disponibles en el medio extracelular. Además, la actividad de transecto-Sial-T2 disminuyó considerablemente cuando la expresión del sustrato aceptor se inhibió mediante el uso de un inhibidor específica de la biosíntesis de glicolípidos, lo que indica la naturaleza lipídica del aceptor. Nuestras resultados proporcionan la primera evidencia directa de una enzima ecto-sialiltransferasa que es capaz de transsialidar sustratos expuestas en la membrana plasmática de células de mamíferos, lo que representa una nueva visión de los acontecimientos moleculares que regulan la composición local de glicoesfingol ípidos. Capítulo III La expresión del gangliósido GD3 juega un rol esencial en el desarrollo normal del sistema nervioso, y disminuye hacia la edad adulta. La transformación maligna de células, en especial aquellas de origen neuro-ectodermal (tales como melanoma y neuroblastoma), resulta en general en una elevada expresión del gangliósido GD3 y otros como GM2, GD2, y 9-0-acetil-GD3. En el tercer capítulo de la tesis, en primera instancia abordamos el transporte endocítico del anticuerpo monoclonal R24, el cual reconoce al gangliósido GD3. El análisis de la internalización y transporte del complejo R24-GD3 fue realizado en la línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1, la línea de melanoma humano SKMel 28 y de ratón B16. Demostramos que el anticuerpo monoclonal (mAb) R24, unido de manera específica al gangliósido GD3, fue internalizado y acumulada en una región perinuclear correspondiente al endosoma de reciclado en las células CHO-K1 y SK-Mel 28, en cambio en las células de melanoma de ratón se observó colocalización con 4 RESUMEN marcadores de endosomas tempranos y lisosomas, indicando un direccionamiento hacia la via degradativa. Por otro lado, se aprovechó la característica de R24 de ser internalizado para el suministro selectivo de saporina en células que expresan GD3 (SK-Mel 28, B16 y CHO -Ki). Esta proteína extraída de las semillas de Saponaria officinalis que tiene la capacidad de inactivar la síntesis de proteínas. Este complejo inmunotóxico R24/Ac-saporina, mostró una citotoxicidad específica en células tumorales crecidas en monocapas, no afectando a células GD3 negativas. Además se evaluó la actividad antineoplásica del complejo R24/Ac-saporina sobre el crecimiento clonogénico de células SK-Mel 28 y CHO-K1 3cultivadas en condiciones libres de adhesión al sustrato. Se observó una inhibición drástica del crecimiento (> 80-90%) de las colonias de células después de 3 días de tratamiento con el complejo inmunotóxico R24/Ac-saporina. Por el contrario, ausencia del anticuerpo R24, o en la ausencia tanto de la inmunotoxina y R24, no se vio afectado el crecimiento de las colonias a la misma concentración de la inmunotoxina (Ac-saporina), indicando la especificidad del efecto observado. De esta forma, el gangliósido GD3 puede ser considerado como una nueva y atractiva molécula de la superficie celular para el direccionamiento de agentes citotóxicos y, por lo tanto, proporciona una base para la futura intervención terapéutica en células neoplásicas con expresión diferencial de gangliósidos.
Fil: Torres Demichelis, Vanina Andrea. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.