Caracterización bioquímica y molecular de la glicosiltransferasa autocatalítica UDP-glucosa : proteína transglucosilasa

• Autores: Wald, Flavia A.
• Año de publicación: 2001
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Moreno, Silvia
• Materia: GLICOSILTRANSFERASAS; GOLGI; PARED CELULAR VEGETAL; POLISACARIDOS; SOLANUM TUBEROSUM L.; UDP-GLUCOSA : PROTEINA TRANSGLUCOSILASA; ZEA MAYS; GLYCOSYLTRANSFERASES; GOLGI; PLANT CELL WALL; POLYSACCHARIDES; SOLANUM TUBEROSUM L.; UDP-GLUCOSE : PROTEIN TRANSGLUCOSYLASE; ZEA MAYS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es unaglicosiltransferasa autocatalítica descripta tanto en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.) como en endosperma de maíz (Zea mays), involucrada en la síntesis de polisacáridos. Encontramos diferentes isoformas de UPTG de papa las cuales se expresaron en E.coli y se caracterizaron bioquímicamente. Las isoformas UPTG1 y UPTG2 no sólopresentan características cinéticas diferentes sino que además se expresan diferencialmenteen los diversos tejidos de la planta. Se encontró una alta expresión de los transcriptos de UPTGl en estolones, tubérculos y raíces mientras que la expresión de los mensajeros de UPTG2 era elevada en todos los tejidos analizados, principalmente en hojas y tallos. Elanálisis del ADN genómico de papa sugiere la existencia de nuevas isoformas de UPTG, loque sumado a la presencia de proteínas homólogas a la UPTG en otras especies vegetales,muestran que dichas glicosiltransferasas autocatalíticas constituirían una pequeña familiamultigénica presente sólo en plantas superiores. Los estudios bioquímicos de la reacción de glicosilación de la UPTG mostraron queun único residuo de glucosa, xilosa o galactosa se une a la enzima en configuración β, conun tipo de unión que se comportaria más bien como las del tipo N. Además, el análisis de lareversibilidad de la reacción de glicosilación mostró que la UPTG catalizaría la ruptura delenlace glicosídico. El estudio de la naturaleza del inhibidor de la UPTG en maíz reveló que éste seria laisoforma SS1 de la sacarosa sintetasa presente principalmente en el endosperma. Laisoforma SS1 ha sido relacionada recientemente con la biosíntesis de polisacáridos de paredcelular y su asociación con la UPTG de maíz aporta una nueva evidencia a favor de dichahipótesis. Los resultados de esta Tesis muestran que la UPTG de papa podía ser fosforilada invitro. El tratamiento con fosfatasa de la proteína UPTG recombinante mostró que ladefosforilación de la UPTG incrementa su glicosilación y que a su vez, la glicosilación dela enzima favorece la aparición de formas de mayor tamaño molecular inmunológicamenterelacionadas con la UPTG. Se piensa que la defosforilación de UPTG incrementaría suglicosilación promoviendo la asociación de la proteína a otras proteínas o a sí misma. Se propone que la proteína UPTG se asociaría funcionalmente a elementos deanclaje, desconocidos hasta el momento, presentes en la membrana del Golgi facilitando eltransporte de los UDP-azúcares sustratos de la biosíntesis de pectinas y hemicelulosas. Así,no podemos descartar que la defosforilación de la UPTG favorezca su asociación amembranas lo que podria involucrar un mecanismo de localización de la enzima. Losresultados con respecto al análisis de la expresión de ARNm de UPTG, sugieren que laenzima se expresaría principalmente en tejidos cuyas células estarían en estado de activocrecimiento y/o elongación. Basados en el hecho que en tejidos en elongación hay unaactiva síntesis principalmente de pectinas y hemicelulosas, los datos mostrados constituyenuna fuerte evidencia que apoya la hipótesis que propone que la UPTG estaría involucradaen la síntesis de los polisacáridos no celulósicos que componen la pared celular vegetal. Más aún, la existencia de isoenzímas redundantes de UPTG sugiere que la enzima formaríapane de un sistema complejo esencial para la viabilidad de la célula vegetal.
The enzyme UDP-glucose: protein transglucosylase (UPTG) is an autocatalyticglycosyltransferase involved in the biosynthesis of polysaccharides, which was described inpotato tubers (Solanum tuberosum L.) and in maize endosperm (Zea mays). We found at least two different UPTG isoforms from potato, we expressed therecombinant proteins in E. coli and their biochemical characteristics were determined. UPTG1 and UPTG2 isoforms not only showed different kinetic properties but also adifferential mRNA expression in potato plants was observed. While UPTG1 expressionwas found predominantly in stolons, tubers and roots, UPTG2 expression was high in allthe analyzed tissues but mainly in stems and leaves. The analysis of the potato genomic DNA suggested the existence of new isoforms of UPTG, what in addition to the presence ofhomologue UPTG proteins showed that these autocatalytic glycosyltransferases constitute asmall multigenic family present only in higher plants. The biochemical analysis of the UPTG glycosylation reaction showed that only oneresidue of glucose, xylose or galactose was bound to the enzyme in β configuration and thatthe carbohydrate behaved like N-glycosidically linked. Furthermore, when we analyzed thereversibility of the glycosylation reaction we found that in the presence of UDP, theglycosidic bond between UPTG and glucose was broken. The nature of the UPTG inhibitor in maize was studied. We found that the SS1isoform of sucrose synthase that is expressed predominantly in the endosperm, wasresponsible for UPTG inhibition. This isoform was recently related to cell wallpolysaccharide biosynthesis and its association with UPTG provides a new evidence thatsupports this hypothesis. The Thesis work showed that the potato UPTG can be phosphorylated in vitro. After phosphatase treatment, an increase in UPTG glycosylation was observed. Furthermore, the enzyme glycosylation promotes the appearance of high molecular weightpolypeptides, which are immunologically related to UPTG. We think that UPTGdephosphorylation could stimulate its glycosylation favoring its association with otherproteins or with itself. We suggest that UPTG may functionally associates to anchoring elements, yetunknown, that are present in Golgi membranes facilitating the UDP-sugars transport fromthe cytosol for the synthesis of pectins and hemicelluloses. We cannot rule out that UPTGdephosphorylation could favor its association to membranes what may involve alocalization mechanism of the enzyme. The results related to the expression of UPTGmRNA, suggested that the enzyme might be mainly expressed in actively growing orelongating tissues. The fact that in elongating tissues there is an active synthesis of pectinsand hemicelluloses in addition to the results presented here, represent a strong evidence thatsupports the hypothesis that UPTG is involved in the synthesis of noncellulosicpolysaccharides that constitute the plant cell wall. Moreover, the existence of redundant UPTG isozymes points out that the enzyme may form part of a complex system essentialfor the viability of the plant cell.
Fil: Wald, Flavia A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.