Rol del factor sigma AlgT y su anti-sigma MucA en el metabolismo anaeróbico de Pseudomonas aeruginosa

• Autores: Hedeman, Laura Gabriela
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Smania, Andrea María; Saka, Héctor Alex; Echenique, José Ricardo; Paraje, María Gabriela; Pettinari, María Julia
• Materia: Biología celular; Pseudomonas aeruginosa; Enfermedades Respiratorias; Fibrosis quística; Genes; Metabolismo; Mutagénesis; Plasma; Patología molecular; Bacterias patógenas
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2024
Fil: Hedeman, Laura Gabriela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que infecta las vías respiratorias de pacientes con fibrosis quística (FQ), causando tanto infecciones agudas como crónicas. Su capacidad infecciosa y su persistencia en las vías aéreas de los pacientes con FQ se basan en su gran capacidad de adaptación a diferentes presiones selectivas, lo que resulta en la emergencia de fenotipos adaptados, como el fenotipo mucoso. Este último, caracterizado principalmente por mutaciones en el gen mucA, se asocia a una peor prognosis para el paciente y marca la transición hacia la irreversibilidad y cronicidad de la infección. El gen mucA codifica un factor anti-sigma que regula negativamente la producción de alginato al secuestrar a AlgT, un factor sigma alternativo responsable de regular la transcripción del operón biosintético de alginato y numerosos otros procesos. La mayoría de las mutaciones en mucA corresponden a deleciones -1 pb en una repetición homopolimérica de 5 G (G5-SSR426), generando el alelo conocido como mucA22, así como diferentes transiciones C por T, que generan codones de terminación prematuros y consecuentemente versiones truncas de la proteína MucA con pérdida de función. La progresión de la enfermedad hacia la cronicidad se caracteriza por la reducción en la tensión de oxígeno, lo que conduce a un aumento de nichos microaeróbicos y anaeróbicos y un aumento en la disponibilidad de nitrato (NO3-) y nitrito (NO2-). Frente a estas condiciones, la bacteria responde con un cambio (switch) metabólico que le permite crecer en condiciones micro/anaeróbicas y utilizar NO3- y NO2- como aceptores finales de electrones. Sin embargo, la asociación entre la mutagénesis en el gen mucA, la conversión consecuente al fenotipo mucoso, y el metabolismo anaeróbico no está aún bien establecida. En esta tesis doctoral, se propone que las variantes truncas de mucA en la región periplásmica mantienen ciertas propiedades regulatorias anti-sigma distintivas sobre AlgT, regulando no sólo la producción de alginato sino también otros procesos relacionados con la desnitrificación y el crecimiento anaeróbico. El objetivo general se enmarca en el estudio de la asociación entre el metabolismo anaérobico y la mutagénesis sesgada al dominio periplásmico de MucA, lo cual afecta la regulación de AlgT. A través de la construcción de un conjunto de mutantes en algT y mucA y su caracterización, se determinó que las variantes truncas de MucA en el dominio periplásmico permanecen funcionales, manteniendo una regulación negativa, aunque parcial, sobre el factor sigma, indicando que mayores niveles de liberación de AlgT son los determinantes para producir un cambio regulatorio y consecuentemente metabólico de la bacteria. Estudios de crecimiento en condiciones anaeróbicas, particularmente en condiciones tóxicas causadas por altas concentraciones de NO2-, junto con ensayos de reversión del fenotipo mucoso, indicaron que la liberación total de AlgT es tóxica para la bacteria, mientras que determinaron que el switch regulatorio causado por la liberación parcial del mismo está asociado, aunque no directamente, al metabolismo de desnitrificación de la bacteria. De hecho, se determinó que la sobreproducción de alginato y la sensibilidad al NO2-, en condiciones anaeróbicas son procesos independientes, sugiriendo que la sensibilidad es una consecuencia de la desregulación de AlgT. Asimismo, mediante análisis proteómicos para investigar el fenómeno de sensibilidad al NO2- en condiciones anaeróbicas, se determinó que mientras la cepa PAO1 mucA22 (liberación parcial de AlgT) muestra una disminución en las proteínas NirS y NirF, factores esenciales para la reducción de NO2- a óxido nítrico (NO), la expresión de estos factores en la mutante PAO1 ΔalgTmucA22 (ausencia de AlgT) aumenta significativamente. Estos hallazgos sugieren un modelo en el que la liberación parcial de AlgT en la cepa mucoide PAO1 mucA22 reduce los niveles de Nir de manera indirecta a través de un desbalance en la transcripción de los operones de desnitrificación mediado por el quorum sensing (QS) y el factor sigma RpoN, lo que genera acumulación de NO2- e intoxicación de la célula. Complementariamente, la desregulación parcial de AlgT, aumenta los niveles de OprF, porina que forma parte del regulón de AlgT y participa en la difusión de NO3- y NO2- hacia el interior celular, lo cual generaría consecuentemente especies intermediarias tóxicas y estrés nitrosativo que afectan los centros catalíticos de diferentes enzimas, especialmente las de desnitrificación. El presente trabajo contribuye al entendimiento de la asociación entre AlgT y su anti-sigma MucA con el metabolismo anaeróbico, como factores cruciales en el establecimiento de infecciones crónicas en pacientes con FQ. Estos hallazgos tienen relevancia clínica al presentar la posibilidad de desarrollar estrategias dirigidas a combatir a estas variantes mucoides, y mejorar la calidad y expectativa de vida de estos pacientes.
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that infects the respiratory tract of cystic fibrosis (CF) patients, causing both acute and chronic infections. Its infectious capacity and persistence in the airways of CF patients are based on its great adaptability to different selective pressures, resulting in the emergence of adapted phenotypes, such as the mucoid phenotype. This phenotype, characterized mainly by mutations in the mucA gene, is associated with a worse prognosis for the patient and marks the transition towards irreversibility and chronicity of the infection. The mucA gene encodes an anti-sigma factor that negatively regulates alginate production by sequestering AlgT, an alternative sigma factor responsible for regulating the transcription of the alginate biosynthetic operon and numerous other processes. Most mutations in mucA correspond to -1 bp deletions in a homopolymeric repeat of 5 G (G5-SSR426), generating the allele known as mucA22, as well as different C-to-T transitions, which generate premature termination codons and consequently truncated versions of the MucA protein with loss of function. Disease progression towards chronicity is characterized by a reduction in oxygen tension, leading to an increase in microaerobic and anaerobic niches and an increase in the availability of nitrate (NO3-) and nitrite (NO2-). Faced with these conditions, the bacterium responds with a metabolic switch that allows it to grow under microaerobic/anaerobic conditions and use NO3- and NO2- as final electron acceptors. However, the association between mutagenesis in the mucA gene, the consequent conversion to the mucoid phenotype, and anaerobic metabolism is not yet well established. The hypothesis of this thesis states that truncated variants of mucA in the periplasmic region maintain certain distinctive anti-sigma regulatory properties over AlgT, regulating not only alginate production but also other processes related to denitrification and anaerobic growth. The general aim of this work is focused on the study of the association between anaerobic metabolism and biased mutagenesis in the periplasmic domain of MucA, which affects AlgT regulation. By constructing a set of mutants in algT and mucA and characterizing it, we determined that truncated variants of MucA in the periplasmic domain remain functional, maintaining a negative, albeit partial, regulation over the sigma factor, indicating that higher levels of AlgT release are crucial for a regulatory and metabolic shift in the bacterium. Growth studies under anaerobic conditions, particularly under toxic conditions caused by high concentrations of NO2-, along with assays to revert the mucoid phenotype, indicated that total release of AlgT is toxic to the bacterium, while partial release of it is associated, although not directly, with the denitrification metabolism of the bacterium. In fact, it was determined that overproduction of alginate and sensitivity to NO2- under anaerobic conditions are independent processes, suggesting that sensitivity is a consequence of AlgT dysregulation. Likewise, through proteomic analysis indicated that while the PAO1 mucA22 strain (partial release of AlgT) shows a decrease in NirS and NirF proteins, essential factors for the reduction of NO2- to nitric oxide (NO), their expression in the PAO1 ΔalgTmucA22 mutant (lack of AlgT) increases significantly. These findings suggest a model in which the partial release of AlgT in the mucoid PAO1 mucA22 strain indirectly reduces Nir levels through an imbalance in the transcription of denitrification operons mediated by quorum sensing (QS) and the RpoN sigma factor, leading to NO2- accumulation and cell intoxication. Additionally, partial dysregulation of AlgT increases OprF levels, a porin that is part of the AlgT regulon and participates in the diffusion of NO3- and NO2- inside the cell, thus generating toxic intermediate species and nitrosative stress that affect the catalytic centers of different enzymes, especially those involved in denitrification. This work contributes to the understanding of the relationship between AlgT and its anti-sigma MucA with anaerobic metabolism, as crucial factors in the establishment of chronic infections in CF patients. These findings are clinically relevant as for developing strategies aimed at mitigate these mucoid variants and improve the quality and life expectancy of these patients.
2026-09-30
Fil: Hedeman, Laura Gabriela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.