Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos

Autores
Villalba, María Leticia
Año de publicación
2021
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
tesis doctoral
Estado
versión aceptada
Colaborador/a o director/a de tesis
Sangorrín, Marcela Paula
Lopes, Christian Ariel
Descripción
El deterioro microbiológico es una preocupación importante en toda la industria del vino y las herramientas de control son limitadas. El uso de las tecnologías emergentes incluye, entre otras, la utilización de toxinas killer como antagonistas biológicos que permitirán reducir la aplicación de dióxido de azufre para inhibir el crecimiento de levaduras contaminantes. Este trabajo aborda la identificación y caracterización de toxinas killer producidas por Torulaspora delbrueckii (NPCC 1033), Wickerhamomyces anomalus (NPCC 1027) y Saccharomyces eubayanus (NPCC 1302) con potencial actividad de biocontrol en cepas contaminantes de vinos. Las tres cepas de levaduras son capaces de inhibir selectivamente el crecimiento de Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens sin afectar el desarrollo de la mayoría de las cepas de S. cerevisiae que se utilizan como cultivos iniciadores del proceso de obtención del vino. Se analizaron estrategias de producción, se optimizaron los medios de cultivo y purificaron las diferentes toxinas. Las tres levaduras presentan un pico máximo de producción de toxina al inicio de la fase estacionaria de los cultivos. Las toxinas obtenidas se purificaron por filtración tangencial, luego por cromatografía de afinidad y se concentraron por membranas de corte molecular. Se obtuvieron extractos con 21,3 UA killer/mg de SeKT, 8,6 UA killer/mg de TdKT y 7,2 UA killer/mg de WaKT. La actividad killer de las tres toxinas se mantiene estable entre pH 3 y 4,5 y son sensibles a temperaturas superiores a los 26 °C. La actividad killer de las tres toxinas no es afectada por concentraciones de hasta 16% v/v de etanol, de hasta 300 g/L de glucosa y de hasta 100 ppm de dióxido de azufre. Solamente SeKT muestra una pérdida de 30 % de actividad en presencia de 160 ppm de dióxido de azufre. Se analizó la estabilidad de las toxinas en vino y en mosto. SeKT muestra mayor estabilidad en vino que en mosto, con una disminución del 20 % de su actividad a las 48 h de incubación en mosto. TdKT presenta un comportamiento similar en mosto y vino, con un 70 y 80 % de descenso a las 48 h de incubación. En el caso de WaKT, la estabilidad en mosto es muy elevada (conservando el 80 % de actividad a las 48 h) pero es mucho más sensible a la incubación en vino, con una pérdida del 80 % de actividad a las 48 h. Con el objetivo de avanzar en la caracterización bioquímica se realizó la optimización de la producción de las tres toxinas en escala de laboratorio. Se aplicaron herramientas estadísticas y de diseño experimental para llevar a cabo la optimización del medio de cultivo para la producción de SeKT, TdKT y WaKT. Se analizó la influencia en la producción de las toxinas killer de la temperatura, velocidad de agitación, agregado de tritón y glicerol al medio de cultivo GPY. Con el objetivo de maximizar la producción de las toxinas se determinaron los niveles óptimos de estos cuatro factores, se utilizó un diseño central compuesto (DCC) y se seleccionaron las 14 condiciones óptimas utilizando la metodología de superficie de respuesta. Para la producción de SeKT la condición óptima fue: 5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; para TdKT: 12,5 v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; y para WaKT: 12,5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm, 20 °C. La producción en condiciones optimizadas aumenta 18 veces la producción de SeKT, 1,6 veces la producción de TdKT y 2,3 veces para WaKT, con respecto a las condiciones sin optimizar. Se avanzó en la caracterización de los mecanismos de acción de las toxinas. Con el objetivo de determinar el receptor primario de la pared de la célula sensible, se analizó la interferencia en la actividad killer con la incubación junto a diferentes componentes de la pared celular. Las toxinas WaKT y TdKT son capaces de interactuar con los β-1,6 glucanos de la pared. Por otra parte, SeKT utiliza como receptor primario los β-1,6 glucanos y los β-1,3 glucanos. SeKT y TdKT se unen a la quitina de las células sensibles. Ninguna de las toxinas se une a las mananoproteínas. Para determinar si el mecanismo de acción de las toxinas involucra la inducción del daño a la pared celular, se determinó la actividad enzimática de las toxinas. WaKT y TdKT presentan actividad quitinasa con aumento proporcional a la actividad killer. Las tres toxinas presentan actividad β-glucanasa, con aumento proporcional a la actividad killer. Los cambios en la morfología de la pared celular de las levaduras sensibles se evidenciaron por la tinción de quitina con Calcofluor White. TdKT y WaKT inducen cambios en la morfología de la pared, mientras que SeKT no altera la integridad de la pared celular. También se estudiaron mecanismos de acción que involucran eventos relacionados con la detención del ciclo celular, inducción de muerte celular programada (apoptosis) y necrosis. Se analizó la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la morfología nuclear por microscopía de fluorescencia, como indicadores de apoptosis. SeKT provoca la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la condensación de la cromatina en los núcleos de las células sensibles. Este efecto no se observó al aumentar la cantidad de SeKT agregada y se detectó muerte celular inmediata (necrosis), con evidencia de fragmentación de la cromatina y pérdida de la integridad de la pared celular. Las células tratadas con TdKT y WaKT no presentan ninguna de las características relacionadas con la inducción de apoptosis. Para definir la posibilidad de la utilización de las toxinas como biocontroladores y evaluar su capacidad de evitar la producción de fenoles volátiles por levaduras contaminantes en vino, se analizó la producción de 4-etilfenol, 4-vinilfenol, 4-etilguayacol y 4-vinilguayacol por Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens incubadas con SeKT y TdKT. La adición de 4 UA de SeKT en los cultivos mostró una disminución 15 de la producción de fenoles volátiles en porcentajes mayores al 94 % después de 100 días para las cuatro especies contaminantes evaluadas. El agregado de 4 UA de TdKT mostró una disminución de la producción de fenoles volátiles en proporciones que van desde el 30 % en P. membranifaciens hasta el 100 % en P. manshurica. Estos resultados permiten proponer a estas toxinas killer como potenciales agentes antimicrobianos naturales para controlar las levaduras contaminantes presentes durante el envejecimiento y almacenamiento del vino.
Fil: Villalba, María Leticia. Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche; Argentina.
Materia
Toxinas killer
Biocontrol
Saccharomyces eubayanus
Torulaspora delbrueckii
Sacch wickerhamomyces anomalus
Biowickerhamomyces anomalus
Levaduras contaminantes del vino
Fenoles volátiles
Mecanismos de acción
Ciencias de la Tierra y Medio Ambiente
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/
Repositorio
Repositorio Digital Institucional (UNCo)
Institución
Universidad Nacional del Comahue
OAI Identificador
oai:rdi.uncoma.edu.ar:uncomaid/16711

id RDIUNCO_ea20f0e14d66f20ecce0a9445abc22f7
oai_identifier_str oai:rdi.uncoma.edu.ar:uncomaid/16711
network_acronym_str RDIUNCO
repository_id_str 7108
network_name_str Repositorio Digital Institucional (UNCo)
spelling Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinosVillalba, María LeticiaToxinas killerBiocontrolSaccharomyces eubayanusTorulaspora delbrueckiiSacch wickerhamomyces anomalusBiowickerhamomyces anomalusLevaduras contaminantes del vinoFenoles volátilesMecanismos de acciónCiencias de la Tierra y Medio AmbienteEl deterioro microbiológico es una preocupación importante en toda la industria del vino y las herramientas de control son limitadas. El uso de las tecnologías emergentes incluye, entre otras, la utilización de toxinas killer como antagonistas biológicos que permitirán reducir la aplicación de dióxido de azufre para inhibir el crecimiento de levaduras contaminantes. Este trabajo aborda la identificación y caracterización de toxinas killer producidas por Torulaspora delbrueckii (NPCC 1033), Wickerhamomyces anomalus (NPCC 1027) y Saccharomyces eubayanus (NPCC 1302) con potencial actividad de biocontrol en cepas contaminantes de vinos. Las tres cepas de levaduras son capaces de inhibir selectivamente el crecimiento de Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens sin afectar el desarrollo de la mayoría de las cepas de S. cerevisiae que se utilizan como cultivos iniciadores del proceso de obtención del vino. Se analizaron estrategias de producción, se optimizaron los medios de cultivo y purificaron las diferentes toxinas. Las tres levaduras presentan un pico máximo de producción de toxina al inicio de la fase estacionaria de los cultivos. Las toxinas obtenidas se purificaron por filtración tangencial, luego por cromatografía de afinidad y se concentraron por membranas de corte molecular. Se obtuvieron extractos con 21,3 UA killer/mg de SeKT, 8,6 UA killer/mg de TdKT y 7,2 UA killer/mg de WaKT. La actividad killer de las tres toxinas se mantiene estable entre pH 3 y 4,5 y son sensibles a temperaturas superiores a los 26 °C. La actividad killer de las tres toxinas no es afectada por concentraciones de hasta 16% v/v de etanol, de hasta 300 g/L de glucosa y de hasta 100 ppm de dióxido de azufre. Solamente SeKT muestra una pérdida de 30 % de actividad en presencia de 160 ppm de dióxido de azufre. Se analizó la estabilidad de las toxinas en vino y en mosto. SeKT muestra mayor estabilidad en vino que en mosto, con una disminución del 20 % de su actividad a las 48 h de incubación en mosto. TdKT presenta un comportamiento similar en mosto y vino, con un 70 y 80 % de descenso a las 48 h de incubación. En el caso de WaKT, la estabilidad en mosto es muy elevada (conservando el 80 % de actividad a las 48 h) pero es mucho más sensible a la incubación en vino, con una pérdida del 80 % de actividad a las 48 h. Con el objetivo de avanzar en la caracterización bioquímica se realizó la optimización de la producción de las tres toxinas en escala de laboratorio. Se aplicaron herramientas estadísticas y de diseño experimental para llevar a cabo la optimización del medio de cultivo para la producción de SeKT, TdKT y WaKT. Se analizó la influencia en la producción de las toxinas killer de la temperatura, velocidad de agitación, agregado de tritón y glicerol al medio de cultivo GPY. Con el objetivo de maximizar la producción de las toxinas se determinaron los niveles óptimos de estos cuatro factores, se utilizó un diseño central compuesto (DCC) y se seleccionaron las 14 condiciones óptimas utilizando la metodología de superficie de respuesta. Para la producción de SeKT la condición óptima fue: 5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; para TdKT: 12,5 v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; y para WaKT: 12,5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm, 20 °C. La producción en condiciones optimizadas aumenta 18 veces la producción de SeKT, 1,6 veces la producción de TdKT y 2,3 veces para WaKT, con respecto a las condiciones sin optimizar. Se avanzó en la caracterización de los mecanismos de acción de las toxinas. Con el objetivo de determinar el receptor primario de la pared de la célula sensible, se analizó la interferencia en la actividad killer con la incubación junto a diferentes componentes de la pared celular. Las toxinas WaKT y TdKT son capaces de interactuar con los β-1,6 glucanos de la pared. Por otra parte, SeKT utiliza como receptor primario los β-1,6 glucanos y los β-1,3 glucanos. SeKT y TdKT se unen a la quitina de las células sensibles. Ninguna de las toxinas se une a las mananoproteínas. Para determinar si el mecanismo de acción de las toxinas involucra la inducción del daño a la pared celular, se determinó la actividad enzimática de las toxinas. WaKT y TdKT presentan actividad quitinasa con aumento proporcional a la actividad killer. Las tres toxinas presentan actividad β-glucanasa, con aumento proporcional a la actividad killer. Los cambios en la morfología de la pared celular de las levaduras sensibles se evidenciaron por la tinción de quitina con Calcofluor White. TdKT y WaKT inducen cambios en la morfología de la pared, mientras que SeKT no altera la integridad de la pared celular. También se estudiaron mecanismos de acción que involucran eventos relacionados con la detención del ciclo celular, inducción de muerte celular programada (apoptosis) y necrosis. Se analizó la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la morfología nuclear por microscopía de fluorescencia, como indicadores de apoptosis. SeKT provoca la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la condensación de la cromatina en los núcleos de las células sensibles. Este efecto no se observó al aumentar la cantidad de SeKT agregada y se detectó muerte celular inmediata (necrosis), con evidencia de fragmentación de la cromatina y pérdida de la integridad de la pared celular. Las células tratadas con TdKT y WaKT no presentan ninguna de las características relacionadas con la inducción de apoptosis. Para definir la posibilidad de la utilización de las toxinas como biocontroladores y evaluar su capacidad de evitar la producción de fenoles volátiles por levaduras contaminantes en vino, se analizó la producción de 4-etilfenol, 4-vinilfenol, 4-etilguayacol y 4-vinilguayacol por Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens incubadas con SeKT y TdKT. La adición de 4 UA de SeKT en los cultivos mostró una disminución 15 de la producción de fenoles volátiles en porcentajes mayores al 94 % después de 100 días para las cuatro especies contaminantes evaluadas. El agregado de 4 UA de TdKT mostró una disminución de la producción de fenoles volátiles en proporciones que van desde el 30 % en P. membranifaciens hasta el 100 % en P. manshurica. Estos resultados permiten proponer a estas toxinas killer como potenciales agentes antimicrobianos naturales para controlar las levaduras contaminantes presentes durante el envejecimiento y almacenamiento del vino.Fil: Villalba, María Leticia. Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche; Argentina.Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche.Sangorrín, Marcela PaulaLopes, Christian Ariel2021info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06info:ar-repo/semantics/tesisDoctoralapplication/pdfapplication/pdfhttp://rdi.uncoma.edu.ar/handle/uncomaid/16711spainfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/reponame:Repositorio Digital Institucional (UNCo)instname:Universidad Nacional del Comahue2025-09-29T14:28:45Zoai:rdi.uncoma.edu.ar:uncomaid/16711instacron:UNCoInstitucionalhttp://rdi.uncoma.edu.ar/Universidad públicaNo correspondehttp://rdi.uncoma.edu.ar/oaimirtha.mateo@biblioteca.uncoma.edu.ar; adriana.acuna@biblioteca.uncoma.edu.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:71082025-09-29 14:28:45.68Repositorio Digital Institucional (UNCo) - Universidad Nacional del Comahuefalse
dc.title.none.fl_str_mv Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
title Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
spellingShingle Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
Villalba, María Leticia
Toxinas killer
Biocontrol
Saccharomyces eubayanus
Torulaspora delbrueckii
Sacch wickerhamomyces anomalus
Biowickerhamomyces anomalus
Levaduras contaminantes del vino
Fenoles volátiles
Mecanismos de acción
Ciencias de la Tierra y Medio Ambiente
title_short Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
title_full Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
title_fullStr Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
title_full_unstemmed Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
title_sort Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
dc.creator.none.fl_str_mv Villalba, María Leticia
author Villalba, María Leticia
author_facet Villalba, María Leticia
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Sangorrín, Marcela Paula
Lopes, Christian Ariel
dc.subject.none.fl_str_mv Toxinas killer
Biocontrol
Saccharomyces eubayanus
Torulaspora delbrueckii
Sacch wickerhamomyces anomalus
Biowickerhamomyces anomalus
Levaduras contaminantes del vino
Fenoles volátiles
Mecanismos de acción
Ciencias de la Tierra y Medio Ambiente
topic Toxinas killer
Biocontrol
Saccharomyces eubayanus
Torulaspora delbrueckii
Sacch wickerhamomyces anomalus
Biowickerhamomyces anomalus
Levaduras contaminantes del vino
Fenoles volátiles
Mecanismos de acción
Ciencias de la Tierra y Medio Ambiente
dc.description.none.fl_txt_mv El deterioro microbiológico es una preocupación importante en toda la industria del vino y las herramientas de control son limitadas. El uso de las tecnologías emergentes incluye, entre otras, la utilización de toxinas killer como antagonistas biológicos que permitirán reducir la aplicación de dióxido de azufre para inhibir el crecimiento de levaduras contaminantes. Este trabajo aborda la identificación y caracterización de toxinas killer producidas por Torulaspora delbrueckii (NPCC 1033), Wickerhamomyces anomalus (NPCC 1027) y Saccharomyces eubayanus (NPCC 1302) con potencial actividad de biocontrol en cepas contaminantes de vinos. Las tres cepas de levaduras son capaces de inhibir selectivamente el crecimiento de Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens sin afectar el desarrollo de la mayoría de las cepas de S. cerevisiae que se utilizan como cultivos iniciadores del proceso de obtención del vino. Se analizaron estrategias de producción, se optimizaron los medios de cultivo y purificaron las diferentes toxinas. Las tres levaduras presentan un pico máximo de producción de toxina al inicio de la fase estacionaria de los cultivos. Las toxinas obtenidas se purificaron por filtración tangencial, luego por cromatografía de afinidad y se concentraron por membranas de corte molecular. Se obtuvieron extractos con 21,3 UA killer/mg de SeKT, 8,6 UA killer/mg de TdKT y 7,2 UA killer/mg de WaKT. La actividad killer de las tres toxinas se mantiene estable entre pH 3 y 4,5 y son sensibles a temperaturas superiores a los 26 °C. La actividad killer de las tres toxinas no es afectada por concentraciones de hasta 16% v/v de etanol, de hasta 300 g/L de glucosa y de hasta 100 ppm de dióxido de azufre. Solamente SeKT muestra una pérdida de 30 % de actividad en presencia de 160 ppm de dióxido de azufre. Se analizó la estabilidad de las toxinas en vino y en mosto. SeKT muestra mayor estabilidad en vino que en mosto, con una disminución del 20 % de su actividad a las 48 h de incubación en mosto. TdKT presenta un comportamiento similar en mosto y vino, con un 70 y 80 % de descenso a las 48 h de incubación. En el caso de WaKT, la estabilidad en mosto es muy elevada (conservando el 80 % de actividad a las 48 h) pero es mucho más sensible a la incubación en vino, con una pérdida del 80 % de actividad a las 48 h. Con el objetivo de avanzar en la caracterización bioquímica se realizó la optimización de la producción de las tres toxinas en escala de laboratorio. Se aplicaron herramientas estadísticas y de diseño experimental para llevar a cabo la optimización del medio de cultivo para la producción de SeKT, TdKT y WaKT. Se analizó la influencia en la producción de las toxinas killer de la temperatura, velocidad de agitación, agregado de tritón y glicerol al medio de cultivo GPY. Con el objetivo de maximizar la producción de las toxinas se determinaron los niveles óptimos de estos cuatro factores, se utilizó un diseño central compuesto (DCC) y se seleccionaron las 14 condiciones óptimas utilizando la metodología de superficie de respuesta. Para la producción de SeKT la condición óptima fue: 5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; para TdKT: 12,5 v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; y para WaKT: 12,5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm, 20 °C. La producción en condiciones optimizadas aumenta 18 veces la producción de SeKT, 1,6 veces la producción de TdKT y 2,3 veces para WaKT, con respecto a las condiciones sin optimizar. Se avanzó en la caracterización de los mecanismos de acción de las toxinas. Con el objetivo de determinar el receptor primario de la pared de la célula sensible, se analizó la interferencia en la actividad killer con la incubación junto a diferentes componentes de la pared celular. Las toxinas WaKT y TdKT son capaces de interactuar con los β-1,6 glucanos de la pared. Por otra parte, SeKT utiliza como receptor primario los β-1,6 glucanos y los β-1,3 glucanos. SeKT y TdKT se unen a la quitina de las células sensibles. Ninguna de las toxinas se une a las mananoproteínas. Para determinar si el mecanismo de acción de las toxinas involucra la inducción del daño a la pared celular, se determinó la actividad enzimática de las toxinas. WaKT y TdKT presentan actividad quitinasa con aumento proporcional a la actividad killer. Las tres toxinas presentan actividad β-glucanasa, con aumento proporcional a la actividad killer. Los cambios en la morfología de la pared celular de las levaduras sensibles se evidenciaron por la tinción de quitina con Calcofluor White. TdKT y WaKT inducen cambios en la morfología de la pared, mientras que SeKT no altera la integridad de la pared celular. También se estudiaron mecanismos de acción que involucran eventos relacionados con la detención del ciclo celular, inducción de muerte celular programada (apoptosis) y necrosis. Se analizó la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la morfología nuclear por microscopía de fluorescencia, como indicadores de apoptosis. SeKT provoca la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la condensación de la cromatina en los núcleos de las células sensibles. Este efecto no se observó al aumentar la cantidad de SeKT agregada y se detectó muerte celular inmediata (necrosis), con evidencia de fragmentación de la cromatina y pérdida de la integridad de la pared celular. Las células tratadas con TdKT y WaKT no presentan ninguna de las características relacionadas con la inducción de apoptosis. Para definir la posibilidad de la utilización de las toxinas como biocontroladores y evaluar su capacidad de evitar la producción de fenoles volátiles por levaduras contaminantes en vino, se analizó la producción de 4-etilfenol, 4-vinilfenol, 4-etilguayacol y 4-vinilguayacol por Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens incubadas con SeKT y TdKT. La adición de 4 UA de SeKT en los cultivos mostró una disminución 15 de la producción de fenoles volátiles en porcentajes mayores al 94 % después de 100 días para las cuatro especies contaminantes evaluadas. El agregado de 4 UA de TdKT mostró una disminución de la producción de fenoles volátiles en proporciones que van desde el 30 % en P. membranifaciens hasta el 100 % en P. manshurica. Estos resultados permiten proponer a estas toxinas killer como potenciales agentes antimicrobianos naturales para controlar las levaduras contaminantes presentes durante el envejecimiento y almacenamiento del vino.
Fil: Villalba, María Leticia. Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche; Argentina.
description El deterioro microbiológico es una preocupación importante en toda la industria del vino y las herramientas de control son limitadas. El uso de las tecnologías emergentes incluye, entre otras, la utilización de toxinas killer como antagonistas biológicos que permitirán reducir la aplicación de dióxido de azufre para inhibir el crecimiento de levaduras contaminantes. Este trabajo aborda la identificación y caracterización de toxinas killer producidas por Torulaspora delbrueckii (NPCC 1033), Wickerhamomyces anomalus (NPCC 1027) y Saccharomyces eubayanus (NPCC 1302) con potencial actividad de biocontrol en cepas contaminantes de vinos. Las tres cepas de levaduras son capaces de inhibir selectivamente el crecimiento de Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens sin afectar el desarrollo de la mayoría de las cepas de S. cerevisiae que se utilizan como cultivos iniciadores del proceso de obtención del vino. Se analizaron estrategias de producción, se optimizaron los medios de cultivo y purificaron las diferentes toxinas. Las tres levaduras presentan un pico máximo de producción de toxina al inicio de la fase estacionaria de los cultivos. Las toxinas obtenidas se purificaron por filtración tangencial, luego por cromatografía de afinidad y se concentraron por membranas de corte molecular. Se obtuvieron extractos con 21,3 UA killer/mg de SeKT, 8,6 UA killer/mg de TdKT y 7,2 UA killer/mg de WaKT. La actividad killer de las tres toxinas se mantiene estable entre pH 3 y 4,5 y son sensibles a temperaturas superiores a los 26 °C. La actividad killer de las tres toxinas no es afectada por concentraciones de hasta 16% v/v de etanol, de hasta 300 g/L de glucosa y de hasta 100 ppm de dióxido de azufre. Solamente SeKT muestra una pérdida de 30 % de actividad en presencia de 160 ppm de dióxido de azufre. Se analizó la estabilidad de las toxinas en vino y en mosto. SeKT muestra mayor estabilidad en vino que en mosto, con una disminución del 20 % de su actividad a las 48 h de incubación en mosto. TdKT presenta un comportamiento similar en mosto y vino, con un 70 y 80 % de descenso a las 48 h de incubación. En el caso de WaKT, la estabilidad en mosto es muy elevada (conservando el 80 % de actividad a las 48 h) pero es mucho más sensible a la incubación en vino, con una pérdida del 80 % de actividad a las 48 h. Con el objetivo de avanzar en la caracterización bioquímica se realizó la optimización de la producción de las tres toxinas en escala de laboratorio. Se aplicaron herramientas estadísticas y de diseño experimental para llevar a cabo la optimización del medio de cultivo para la producción de SeKT, TdKT y WaKT. Se analizó la influencia en la producción de las toxinas killer de la temperatura, velocidad de agitación, agregado de tritón y glicerol al medio de cultivo GPY. Con el objetivo de maximizar la producción de las toxinas se determinaron los niveles óptimos de estos cuatro factores, se utilizó un diseño central compuesto (DCC) y se seleccionaron las 14 condiciones óptimas utilizando la metodología de superficie de respuesta. Para la producción de SeKT la condición óptima fue: 5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; para TdKT: 12,5 v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; y para WaKT: 12,5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm, 20 °C. La producción en condiciones optimizadas aumenta 18 veces la producción de SeKT, 1,6 veces la producción de TdKT y 2,3 veces para WaKT, con respecto a las condiciones sin optimizar. Se avanzó en la caracterización de los mecanismos de acción de las toxinas. Con el objetivo de determinar el receptor primario de la pared de la célula sensible, se analizó la interferencia en la actividad killer con la incubación junto a diferentes componentes de la pared celular. Las toxinas WaKT y TdKT son capaces de interactuar con los β-1,6 glucanos de la pared. Por otra parte, SeKT utiliza como receptor primario los β-1,6 glucanos y los β-1,3 glucanos. SeKT y TdKT se unen a la quitina de las células sensibles. Ninguna de las toxinas se une a las mananoproteínas. Para determinar si el mecanismo de acción de las toxinas involucra la inducción del daño a la pared celular, se determinó la actividad enzimática de las toxinas. WaKT y TdKT presentan actividad quitinasa con aumento proporcional a la actividad killer. Las tres toxinas presentan actividad β-glucanasa, con aumento proporcional a la actividad killer. Los cambios en la morfología de la pared celular de las levaduras sensibles se evidenciaron por la tinción de quitina con Calcofluor White. TdKT y WaKT inducen cambios en la morfología de la pared, mientras que SeKT no altera la integridad de la pared celular. También se estudiaron mecanismos de acción que involucran eventos relacionados con la detención del ciclo celular, inducción de muerte celular programada (apoptosis) y necrosis. Se analizó la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la morfología nuclear por microscopía de fluorescencia, como indicadores de apoptosis. SeKT provoca la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la condensación de la cromatina en los núcleos de las células sensibles. Este efecto no se observó al aumentar la cantidad de SeKT agregada y se detectó muerte celular inmediata (necrosis), con evidencia de fragmentación de la cromatina y pérdida de la integridad de la pared celular. Las células tratadas con TdKT y WaKT no presentan ninguna de las características relacionadas con la inducción de apoptosis. Para definir la posibilidad de la utilización de las toxinas como biocontroladores y evaluar su capacidad de evitar la producción de fenoles volátiles por levaduras contaminantes en vino, se analizó la producción de 4-etilfenol, 4-vinilfenol, 4-etilguayacol y 4-vinilguayacol por Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens incubadas con SeKT y TdKT. La adición de 4 UA de SeKT en los cultivos mostró una disminución 15 de la producción de fenoles volátiles en porcentajes mayores al 94 % después de 100 días para las cuatro especies contaminantes evaluadas. El agregado de 4 UA de TdKT mostró una disminución de la producción de fenoles volátiles en proporciones que van desde el 30 % en P. membranifaciens hasta el 100 % en P. manshurica. Estos resultados permiten proponer a estas toxinas killer como potenciales agentes antimicrobianos naturales para controlar las levaduras contaminantes presentes durante el envejecimiento y almacenamiento del vino.
publishDate 2021
dc.date.none.fl_str_mv 2021
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
http://purl.org/coar/resource_type/c_db06
info:ar-repo/semantics/tesisDoctoral
format doctoralThesis
status_str acceptedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv http://rdi.uncoma.edu.ar/handle/uncomaid/16711
url http://rdi.uncoma.edu.ar/handle/uncomaid/16711
dc.language.none.fl_str_mv spa
language spa
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/
eu_rights_str_mv openAccess
rights_invalid_str_mv https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche.
publisher.none.fl_str_mv Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche.
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositorio Digital Institucional (UNCo)
instname:Universidad Nacional del Comahue
reponame_str Repositorio Digital Institucional (UNCo)
collection Repositorio Digital Institucional (UNCo)
instname_str Universidad Nacional del Comahue
repository.name.fl_str_mv Repositorio Digital Institucional (UNCo) - Universidad Nacional del Comahue
repository.mail.fl_str_mv mirtha.mateo@biblioteca.uncoma.edu.ar; adriana.acuna@biblioteca.uncoma.edu.ar
_version_ 1844621549221445632
score 12.559606