Caracterización de Bacillus subtilis y B. pumilus con actividad antagónica en cepas Shigatoxigénicas de Escherichia coli. Utilidad para el control de la contaminación en reservorio...

• Autores: Blanco Crivelli, Ximena
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Betancor, Adriana B.
• Materia: Bacillus subtilis; Bacillus pumilus; Antagonismo; STEC; Bacillus subtilis; Bacillus pumilus; Antagonic; STEC; Microbiología; Contaminación; Ciencias Veterinarias
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is a zoonotic pathogen belonging to the Enterobacteriaceae family, commonly associated with hemolytic uremic syndrome (HUS). HUS primarily affects infants and young children, potentially causing renal pathology or leading to patient death. Cattle are the main reservoir of STEC. To reduce the burden of STEC in meat, several pre-slaughter and post-slaughter control strategies have been established. \nIn this study, six native strains of Bacillus spp. were evaluated, pre-selected for their antagonistic activity against STEC. Biochemical identification of the strains was performed, showing phenotypic characteristics consistent with the Bacillus genus. \nNotably, these strains exhibited growth at acidic pH (4.5) and tolerance to 40% bile. The strains were identified as B. amyloliquefaciens S12, B. subtilis S32, B. subtilis S41, B. amyloliquefaciens S44, B. amyloliquefaciens S45, and B. pumilus S178 using PCR of the ytcP gene and MALDI-TOF. Furthermore, all strains were sensitive to ciprofloxacin, levofloxacin, and rifampicin. Moreover, simultaneous inhibition assays of the Bacillus spp. strains were conducted against STEC serotypes at temperatures of 12°C, 29°C, and 37°C, and at acidic, neutral, and basic pH (37°C). B. pumilus S178 was selected as a candidate strain due to its inhibition of all tested STEC strains at the three evaluated temperatures and pH levels, showing the most significant inhibitory effects compared to the other evaluated strains. In conducting the selectivity, inclusivity, and exclusivity assay, B. pumilus S178 inhibited 100% of the STEC strains it was confronted with, demonstrating a high inhibitory activity in 83.3% of the cases. The inhibitory activity was also assessed against E. coli strains that were not STEC, including diarrheagenic and uropathogenic pathovars of E. coli. The results demonstrated a 100% inhibition rate in this group of strains. \nRegarding non-E. coli strains, only one strain of Salmonella spp. and one strain of Serratia spp. were inhibited, which accounted for 18% of the evaluated strains. \nThe time limit for detecting inhibition was established at 72 hours. In the evaluation of inhibition in minimal media for the peptone water case, where both B. pumilus S178 and the STEC strains showed growth, no inhibition was observed. Moreover, inhibition was more pronounced in fresh cultures, with a higher proportion of vegetative cells. \nWhen evaluating the production of an inhibitory substance in solid medium, early inhibition of the STEC strain was observed in deferred inhibition assays. However, obtaining an inhibitory substance through cultivation in liquid medium and filtration, with or without additional processes like concentration or lyophilization, was not possible. \nThere was also no evidence of B. pumilus S178 blocking the quorum sensing of STEC. \nInhibition was not mediated by a volatile substance. Furthermore, B. pumilus S178 did not activate the lytic cycle of the lambda phage in the evaluated STEC strains, further affirming its safety as a strategy for controlling animal reservoirs of the pathogen. \nThe study of the sporulation process allowed us to establish that sporulation of B. pumilus S178 begins on day 3, reaching its peak spore formation at 7 days in solid medium (89%), and at 8 days in liquid medium (41%). Additionally, a 60-minute lag phase in bacterial growth was observed when B. pumilus S178 was cultivated in brain heart broth and then replicated on tryptone soy broth. The germination process was studied, and it varied depending on the treatment used for spore obtaining, being 40 min when a thermal treatment was applied and 76 min when an alcoholic treatment was used. When evaluating the relationship between germination processes, sporulation processes, and the antagonism observed in STEC strains, it was inferred that due to the brief germination in B. pumilus S178, it may not be associated with the antagonistic effect. \nHowever, a possible relationship with sporulation cannot be ruled out. \nRegarding the safety assessment, B. pumilus S178 was found to be non-pathogenic when orally inoculated in 14-week-old guinea pigs for 7 consecutive days. The animals did not show clinical signs, and no significant differences in body weight were observed between the inoculated and control groups. The qualitative evaluation of the duodenum showed significant differences in favor of the inoculated group regarding mucosal integrity, suggesting a protective effect of the studied strain. Additionally, macroscopic, and microscopic evaluation of the liver and large intestine did not reveal any lesions or lymphoid depletion in the assessment of secondary lymphoid organs. In the quantitative evaluation of the duodenum, no differences were detected, indicating that B. pumilus S178 did not increase the digestive function of the inoculated animals. \nThe inclusion of B. pumilus S178 in silages had no impact on the physical, chemical, and nutritional characteristics of sorghum silage after inoculation with vegetative and spore cultures (total culture) and spore-only cultures. The recovery of microorganisms from the silage was higher in silage inoculated with the total culture. Moreover, compatible strains with the native inoculated strains in both vegetative and spore form were recovered from the silage inoculated with the total culture, which inhibited the EDL 933 strain. This situation was not observed in the silage inoculated with the previously heat-treated culture. \nIn conclusion, B. pumilus S178 shows promise as an adequate pre-slaughter control strategy for STEC due to its inhibitory action on STEC strains and its potential incorporation into sorghum silages, where it is more effective as a total culture.
Fil: Blanco Crivelli, Ximena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno zoonótico perteneciente a la familia Enterobacteriaceae comúnmente asociado a síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH afecta principalmente a lactantes y niños en la primera infancia pudiendo causar patología renal o derivar en la muerte del paciente. \nLos bovinos constituyen el principal reservorio de STEC. Con el fin de disminuir la carga de STEC en la carne, se han establecido varias estrategias pre-faena y post-faena de control. En el presente trabajo se evaluaron 6 cepas autóctonas de Bacillus spp. que fueron pre-seleccionadas por su actividad antagónica contra STEC. Se realizó la identificación bioquímica de las cepas en estudio. Las características fenotípicas observadas se correspondieron con aquellas del género Bacillus, dentro de las mismas se destacan el crecimiento a pH ácido (4,5) y la tolerancia a bilis al 40%. Las cepas fueron identificadas como B. amyloliquefaciens S12, B. subtilis S32, B. subtilis S41, B. amyloliquefaciens S44, B. amyloliquefaciens S45, B. pumilus S178 mediante PCR del gen ytcP y MALDI-TOF. Además, todas las cepas fueron sensibles a la ciprofloxacina, a la levofloxacina y a la rifampicina. \nPosteriormente, se realizaron ensayos de inhibición simultánea de las cepas de Bacillus spp. en estudio con serotipos STEC de impacto en salud a temperaturas de 12°C, 29°C y 37°C, y a pH ácido, neutro y básico (37°C). Se seleccionó como cepa candidata B. pumilus S178 debido a que ejerció inhibición sobre todas en las cepas STEC a las 3 temperaturas evaluadas, ejerció los mejores efectos inhibitorios a los 3 pH evaluados y comenzó su inhibición en forma más temprana que el resto de las cepas evaluadas. Al realizar el ensayo de selectividad, inclusividad y exclusividad, B. pumilus S178 inhibió al 100% de las cepas STEC con las que se la enfrentó, demostrando una actividad inhibitoria alta en un 83,3% de los casos e inhibió al 100% de las cepas E. coli no STEC, grupo que incluyó cepas pertenecientes a patovares diarreogénicos y uropatógenos de E. coli. En lo que a las cepas no E. coli respecta, sólo fueron inhibidas una cepa de Salmonella spp. y una de Serratia spp lo que constituyó un 18% de las cepas evaluadas. \nEl tiempo límite de detección de la inhibición se estableció en 72 h. En la evaluación de inhibición en medios mínimos para el caso del agua de peptona, donde hubo desarrollo tanto de B. pumilus S178 como de las cepas STEC, no se observó inhibición. \nAsimismo, la inhibición fue mayor en cultivos frescos, es decir con una mayor proporción de células vegetativas. Al evaluar la producción de una sustancia inhibitoria en medio sólido se observó una inhibición temprana de la cepa STEC en ensayos de inhibición diferida. La obtención de una sustancia inhibitoria mediate cultivo en medio líquido y filtración ya sea con o sin algún otro procesamiento posterior como el de concentración o liofilización no fue posible. Tampoco se observó bloqueo del quorum sensing de STEC por parte de B. pumilus S178. La inhibición no fue mediada por una sustancia volátil. \nAdemás, B. pumilus S178 no activó el ciclo lítico del fago lambda de las cepas STEC evaluadas, lo que reafirma la seguridad en su uso como estrategia de control de reservorios animales del patógeno. \nEl estudio del proceso de esporulación permitió establecer que la esporulación de B. pumilus S178 comienza al día 3 alcanzado en medio sólido su máximo a los 7 días (89%), y en medio líquido a los 8 días (41%). Además, se determinó un tiempo de 60 min en la fase lag de la curva de crecimiento bacteriana cuando B. pumilus S178 cultivado en caldo cerebro corazón se repica a caldo tripteína soja. El proceso de germinación fue estudiado, el mismo varió en función del tratamiento utilizado para la obtención de esporas, siendo 40 min cuando se utilizó tratamiento térmico y 76 min cuando se utilizó tratamiento alcohólico. Al evaluar la relación entre los procesos de germinación, de esporulación, y el antagonismo producido en cepas STEC, se infirió que debido a que la germinación en B. pumilus S178 es breve, no tendría relación con el efecto antagónico. Sin embargo, no es posible descartar una posible relación con la esporulación. \nB. pumilus S178, al ser inoculada vía oral en cobayos de 14 semanas de edad a dosis constante durante 7 días consecutivos, resultó ser inocua. Los animales evaluados no manifestaron signos clínicos. No se observaron diferencias entre el grupo inoculado y el grupo control respecto a la variable peso corporal. En la evaluación cualitativa del duodeno se evaluaron las variables inflamación de la mucosa e integridad, observándose diferencias significativas a favor del grupo inoculado sólo para la variable integridad lo que sugiere un efecto protector por parte de la cepa en estudio. Además, al evaluar macro y microscópicamente al hígado y al intestino grueso no se observaron lesiones, ni depleción linfoidea tras evaluar órganos linfoides secundarios. En la evaluación cuantitativa del duodeno, no se detectaron diferencias entre los grupos inoculado y control en las variables largo de la vellosidad intestinal y profundidad de la cripta de Lieberkhün; por lo que la cepa B. pumilus S178 no aumentaría la función digestiva de los animales inoculados. \nLa incorporación de la cepa B. pumilus S178 en silajes no alteró las características físico-químicas y nutricionales de minisilos de sorgo tras ser inoculados con cultivos con células vegetativas y esporas (cultivo total) y cultivos únicamente esporulados. La cantidad de microorganismos recuperados a partir del silo fue mayor en silos inoculados con cultivo total. Asimismo, en el silo inoculado con el cultivo total fue posible recuperar cepas compatibles con las cepas autóctonas inoculadas en forma vegetativa y de espora, las cuales inhibieron a la cepa EDL 933. Esta situación no se observó en el silo inoculado con el cultivo con tratamiento calórico previo. \nSe concluye que B. pumilus S178 podría constituir una adecuada estrategia de control de STEC pre-faena debido a su acción inhibitoria sobre cepas STEC y a su posible incorporación a silajes de sorgo siendo más efectivo como cultivo total.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias