Caracterización de las variantes del virus de bronquitis infecciosa que infectan los planteles avícolas de la Argentina y su relación con las vacunas comerciales

• Autores: Geréz Miranda, Rocío del Carmen
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Marandino, Ana; Vagnozzi, Ariel Eduardo
• Materia: Bronquitis infecciosa aviar; Ciliostasis; Modelo de infección; IBV; Virus; Bronquitis aviar; Argentina; Ciencias Veterinarias
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Avian Infectious Bronchitis (IB) is a highly contagious disease of chickens that affects all productive categories in the poultry industry. The etiological agent is Infectious Bronchitis Virus (IBV), a member of the Coronaviridae family. IBV is a pleomorphic virus, with a positive-sense\nsingle-stranded RNA (+ssRNA) that codes for 4 structural proteins. The spike protein (S) is the\nmost important among them because its roles in i) attachment to the host cell; ii) tropism; and iii)\nimmunogenicity. The immune response is based on the production of neutralizing antibodies\ndirected against the antigenic determinants located on some domains of the subunit S1 of S\nprotein. Those domains are highly variable regions (HVR), which are poorly conserved among\nthe different strains, which is the cause of existence of a diversity of IBV variants with limited or no cross protection. The IBV variants can be characterized through virus neutralization essays by use of reference antisera, which allows to determine viral serotypes. In general, it is considered\nthat infection or vaccination against a serotype grants low to insignificant protection against a heterologous virus. The genomic area that encodes S1 was also used for genotyping. The\ngenotype characterization has shown that in Argentina two field variants belonging to the lineages GI-11 and GI-16 co-exist, being the latter the most prevalent. Until 2013, the IBV control in our\ncountry was based on two vaccine serotypes; Massachusetts (Mass) and Connecticut (Conn),\nsince then the 793/B serotype was added to the catalog of authorized vaccines. However, only\nrecently (and in our lab), we started to evaluate the antigenic similarities between field strains and\nvaccine serotypes.\nIn this thesis, we completed the antigenic characterization of A13 strain (GI-16 lineage),\ndetermining its relationship with the commercial vaccine?s serotypes. This achievement was\naccomplished by cross virus-neutralization (CVN) tests, performed first on chicken embryos (ChE)\nand after that on primary cell culture. For the latter, we adapted a chicken embryo kidney cell (ChEK) culture, which is less time and costs demanding when it is compared with ChE. Therefore, we determined that A13 (GI-16), CHu8 (GI-11), Ma5 (GI-1) and CR88 (GI-13) belong to different\nserotypes. That result strongly suggests that we need to review the IB control programs, considering the potential use of a vaccine strain that is homologous to the field variant (GI-16),\nwhich is currently not commercially available. Thus, it would be a remarkable contribution to the IB control in Argentina, if we had a vaccine belonging to GI-16 lineage. So, it becomes essential\nto obtain an attenuated strain of IBV (GI-16 lineage), that could be considered for vaccination.Accordingly, an attenuated A13 strain was obtained by serial passages in ChE, and its potential\nas vaccine candidate was evaluated afterwards. Those evaluations were based upon the use of\nthe following essays: i) safety trial (strain A13 was inoculated at high dose [109.624 EID50/ml]\nwithout disease signs or lesions appearance in the birds); ii) immunogenicity (strain A13 was inoculated at a lower dose [105 EID50/ml] inducing a proper antibody titer); iii) stability (no reversion after 4 serial infections by natural contact); and iv) vaccine efficiency against a challenge with a\nhomologous strain (compared with the protection given by vaccination with commercial vaccines of Massachusetts and 793/B serotypes). In order to perform the challenge trial, we developed (or\nadapted) and optimized techniques, which resulted of critical importance for the vaccine evaluation. They were: i) viral load quantitation in tracheal and kidney tissues (by real time RTPCR); and ii) a score system for ciliostasis evaluation (in tracheal tissue). On the other hand, in this thesis, we also performed a viral evolution study using as input the\nnucleotide sequences of some of the viral serial passages (on different biological supports) of IBV\nstrains. The aim was to analyze the nucleotide sequence of the viral genome in search of changes that can be associated with phenotypic modifications (e.g.: attenuation of virulence). The evolution study has shown that the nucleotides (and the encoded amino acids) changes occurred mostly in: ORF1 and S1. Unfortunately, we were unable to detect a pattern of nucleotide that allows us\nto associate it to changes in virulence or in viral adaptation to a particular host. In summary, in this thesis we have antigenically characterized the main field strain of IBV (GI-16)\naffecting the Argentinian poultry industry, determining the lack of relationship with the serotypes included in the commercial vaccines. Additionally, we obtained a vaccine candidate, homologous with the field variant, which accomplishes the safety standards, conferring a more efficient\nprotection than that provided by commercial vaccines
Fil: Geréz Miranda, Rocío del Carmen. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
La Bronquitis Infecciosa (BI) de las aves es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta a todas las categorías productivas en la industria avícola. El agente etiológico es el virus de la Bronquitis Infecciosa (IBV), un miembro de la familia Coronaviridae. Es un virus pleomórfico, cuyo genoma de RNA de simple cadena (+ssRNA) codifica 4 proteínas estructurales. Entre ellas, la más importante es la proteína de la espícula (S) por su rol en la adherencia a la célula\nhospedadora, tropismo e inmunogenicidad. La respuesta inmune se basa en la producción de\nanticuerpos neutralizantes dirigidos contra determinantes antigénicos de dominios ubicados en\nla subunidad S1 de la proteína S. Estos dominios presentan alta variabilidad, por lo que existen\ndiversas variantes de IBV con escasa o nula protección cruzada. Las variantes pueden ser\ncaracterizadas mediante ensayos de virus neutralización con sueros de referencia lo que permite\nestablecer serotipos virales. En general, se considera que la infección o vacunación con un\nserotipo otorga protección baja o insignificante contra la infección de un virus heterólogo. La región genómica que codifica la subunidad S1 también ha sido empleada para la caracterización\ngenética de IBV. En base a esta caracterización se ha determinado que en Argentina existen dos\nvariantes de campo pertenecientes a los linajes GI-11 y GI-16, siendo este último el más prevalente en la actualidad. En nuestro país, durante décadas el control de la enfermedad estuvo basada en el uso de dos serotipos vacunales, Massachusetts (Mass) y Connecticut (Conn), hasta\nque en el 2013 se autorizó el uso del serotipo 793/B. Sin embargo, solo recientemente, y en\nnuestro laboratorio, se comenzó a trabajar en estudiar las similitudes antigénicas de las cepas\nde campo y los serotipos vacunales. En esta tesis se alcanzó el objetivo de caracterizar antigénicamente a la cepa de campo A13 (linaje GI-16) determinando su relación con las vacunas comerciales. Ello se logró mediante la técnica de virus neutralización cruzada empleando (en una primera instancia) embriones de pollo (EP). Posteriormente, se implementó un sistema de cultivo primario de riñón de embrión de pollo\n(ChEK) mucho menos laborioso y costoso que el de EP. De este modo, se estableció que las\ncepas A13 (GI-16), CHu8 (GI-11), Ma5 (GI-1) y CR88 (GI-13) pertenecen a serotipos diferentes.\nEste resultado sugiere la necesidad de replantear las actuales estrategias de prevención considerando el uso de una vacuna homóloga a la variante de campo (GI-16), que al día de la fecha no existe disponible comercialmente. De este modo, la posibilidad de contar con una\nvacuna perteneciente al linaje GI-16 contribuiría al control de BI en nuestro país. Para ello es\nnecesario, en primer lugar, contar con una cepa perteneciente al linaje GI-16 con potencial para\nser usada como vacuna atenuada. Es así como en este trabajo primero se obtuvo, mediante\npasajes en serie en EP, una cepa (A13) atenuada, que posteriormente fue evaluada para ponderar su potencial como candidata vacunal. Esta evaluación se basó en la aplicación de las\nsiguientes las pruebas: i) inocuidad, administrada en dosis elevada (109,624 DIE50/ml) a pollitos de\nun día no generó trastornos de salud), inmunogenicidad, adecuados títulos de anticuerpos en todos los pollos inoculados (a una dosis de 105 DIE50/ml), iii) estabilidad (no revirtió luego de 4 pasajes por contacto natural) y iv) mayor eficiencia ante el desafío con una cepa homóloga\n(comparada con vacunas comerciales de los serotipos Massachusetts y 793/B). Para la prueba de desafío se desarrollaron y/o adaptaron técnicas que fueron optimizadas para su empleo. Dos de ellas fueron críticas para la evaluación: i) la cuantificación de la carga viral en tráquea y riñón\nmediante una RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) y ii) la prueba de la ciliostasis en muestras de tráquea (mediante sistema de scores). Por otro lado, en este trabajo también se realizó un estudio de evolución viral empleando como insumo algunos pasajes en serie (en distintos soportes biológicos) de diferentes cepas de IBV. El objetivo fue obtener variantes que contengan cambios fenotípicos (virulencia) y evaluar si los mismos estaban relacionados a cambios del genoma. Además, algunos de esos pasajes sirvieron para otros ensayos de esta tesis (obtención del candidato vacunal y el virus de desafío\npara el ensayo de eficiencia). El estudio de evolución viral demostró que la mayoría de los\ncambios de nucleótidos (y aminoácidos codificados) se producen en el ORF1 y en el gen S (fundamentalmente en la subunidad S1). Lamentablemente, en este estudio no se ha logrado\ndetectar un patrón de cambios en la secuencia de nucleótidos que permita asociarlos a la replicación en un hospedador en particular o a cambios en la virulencia. En síntesis, los resultados obtenidos en esta tesis permitieron caracterizar antigénicamente a la\ncepa de mayor circulación en la industria avícola argentina, determinar su falta de relación con\nlas vacunas comerciales, y obtener un candidato vacunal que cumple con los estándares de seguridad y otorga una adecuada respuesta inmune ante un desafío homólogo
Medicina Veterinaria
Doctora de la Universidad de Buenos Aires