Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo d...

Autores
Rojas, María Florencia; Konig, Guido Alberto; Vagnozzi, Ariel Eduardo; Vera, Federico Sebastian; Scolaro, Luis Alberto; Craig, María Isabel
Año de publicación
2020
Idioma
inglés
Tipo de recurso
artículo
Estado
versión aceptada
Descripción
A previous sequence analysis of a US5 gene fragment of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) performed in an Argentinian epidemiological study allowed to differentiate between wild and vaccine strains. This analysis also defined five ILTV haplotypes with specific variations at positions 461, 484, 832, 878 and 894 of the US5 gene. This characterization of viral strains may also be accomplished using the High-Resolution Melting Analysis (HRMA), which has been described as an effective, fast and sensitive method to detect mutations in PCR products. In the present study, an HRM protocol was developed with the aim of characterizing the circulating ILTV strains in Argentina. The specificity of this tool was confirmed in different DNA diluents, without interference from heterologous DNA or other cellular metabolites. Additionally, the salt concentration in the elution buffer used for DNA extraction did not alter the curve profiles. Higher concentrations of DNA (Ct ≅ 26.0) displayed well-defined curve profiles, whereas lower concentrations (Ct ≅ 32.5) exhibited more heterogeneous curves. The HRMA showed 97.49% concordance with the reference technique, i.e., sequencing. The HRM protocol has the capability to perform DNA amplification prior to its characterization. Thus, eventually this technique may be used simultaneously as a diagnostic tool. This advantage implies a significant reduction in the time and effort involved in sample processing.
En un estudio epidemiológico realizado previamente en Argentina, se analizó la secuencia de un fragmento del gen US5 del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), lo que permitió diferenciar las cepas de campo de las vacunales. También esto permitió definir cinco haplotipos del ILTV, con variaciones específicas en las posiciones 461, 484, 832, 878 y 894 del gen US5. La caracterización de las cepas virales también puede lograrse mediante el análisis de la disociación de alta resolución o high-resolution melting analysis (HRMA), descripto como un método efectivo, rápido y sensible para detectar mutaciones en productos de PCR. En el presente estudio se desarrolló un protocolo de disociación de alta resolución con el objetivo de caracterizar cepas del ILTV circulantes en Argentina. Para ello,se confirmó la especificidad de esta herramienta en diferentes diluyentes del ADN de las muestras, sin observarse interferencias en presencia de ADN heterólogo u otros metabolitos celulares. Asimismo, la concentración de sales en el buffer de elución utilizado durante la extracción de ADN no alteró los perfiles de las curvas. Se obtuvieron perfiles bien definidos con concentraciones de ADN más elevadas (Ct ≅ 26.0), mientras que concentraciones más bajas presentaron curvas heterogéneas (Ct ≅ 32.5). El HRMA mostró una concordancia del 97.49% con la técnica de referencia, la secuenciación. El protocolo de disociación de alta resolución amplifica el ADN antes de su caracterización, por lo que esta técnica podría ser eventualmente utilizada para confirmar la presencia del ILTV y, al mismo tiempo, distinguir haplotipos, optimizando su valor como herramienta de diagnóstico. Esta característica implica una reducción significativa en el tiempo dedicado al procesamiento de muestras.
EEA Concepción del Uruguay
Fil: Rojas, Marí­a Florencia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio de Sanidad Aviar; Argentina
Fil: Konig, Guido Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina
Fil: Vagnozzi, Ariel Eduardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina
Fil: Vera, Federico Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio Sanidad Aviar; Argentina
Fil: Scolaro, Luis Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina
Fil: Craig, Marí­a Isabel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina
Fuente
Revista Argentina de Microbiología (Available online 10 September 2020)
Materia
Enfermedades de los Animales
Laringotraqueitis
Virus Bronquitis Infecciosa Aviar
Genética
Animal Diseases
Laryngotracheitis
Avian Infectious Bronchitis Virus
Genetics
Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa Aviar
Avian Infectious Laryngotracheitis Virus
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Repositorio
INTA Digital (INTA)
Institución
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
OAI Identificador
oai:localhost:20.500.12123/7988

id INTADig_15fa7dc0fb58f83d967867f85cf1f2cd
oai_identifier_str oai:localhost:20.500.12123/7988
network_acronym_str INTADig
repository_id_str l
network_name_str INTA Digital (INTA)
spelling Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviarRojas, María FlorenciaKonig, Guido AlbertoVagnozzi, Ariel EduardoVera, Federico SebastianScolaro, Luis AlbertoCraig, María IsabelEnfermedades de los AnimalesLaringotraqueitisVirus Bronquitis Infecciosa AviarGenéticaAnimal DiseasesLaryngotracheitisAvian Infectious Bronchitis VirusGeneticsVirus de la Laringotraqueítis Infecciosa AviarAvian Infectious Laryngotracheitis VirusA previous sequence analysis of a US5 gene fragment of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) performed in an Argentinian epidemiological study allowed to differentiate between wild and vaccine strains. This analysis also defined five ILTV haplotypes with specific variations at positions 461, 484, 832, 878 and 894 of the US5 gene. This characterization of viral strains may also be accomplished using the High-Resolution Melting Analysis (HRMA), which has been described as an effective, fast and sensitive method to detect mutations in PCR products. In the present study, an HRM protocol was developed with the aim of characterizing the circulating ILTV strains in Argentina. The specificity of this tool was confirmed in different DNA diluents, without interference from heterologous DNA or other cellular metabolites. Additionally, the salt concentration in the elution buffer used for DNA extraction did not alter the curve profiles. Higher concentrations of DNA (Ct ≅ 26.0) displayed well-defined curve profiles, whereas lower concentrations (Ct ≅ 32.5) exhibited more heterogeneous curves. The HRMA showed 97.49% concordance with the reference technique, i.e., sequencing. The HRM protocol has the capability to perform DNA amplification prior to its characterization. Thus, eventually this technique may be used simultaneously as a diagnostic tool. This advantage implies a significant reduction in the time and effort involved in sample processing.En un estudio epidemiológico realizado previamente en Argentina, se analizó la secuencia de un fragmento del gen US5 del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), lo que permitió diferenciar las cepas de campo de las vacunales. También esto permitió definir cinco haplotipos del ILTV, con variaciones específicas en las posiciones 461, 484, 832, 878 y 894 del gen US5. La caracterización de las cepas virales también puede lograrse mediante el análisis de la disociación de alta resolución o high-resolution melting analysis (HRMA), descripto como un método efectivo, rápido y sensible para detectar mutaciones en productos de PCR. En el presente estudio se desarrolló un protocolo de disociación de alta resolución con el objetivo de caracterizar cepas del ILTV circulantes en Argentina. Para ello,se confirmó la especificidad de esta herramienta en diferentes diluyentes del ADN de las muestras, sin observarse interferencias en presencia de ADN heterólogo u otros metabolitos celulares. Asimismo, la concentración de sales en el buffer de elución utilizado durante la extracción de ADN no alteró los perfiles de las curvas. Se obtuvieron perfiles bien definidos con concentraciones de ADN más elevadas (Ct ≅ 26.0), mientras que concentraciones más bajas presentaron curvas heterogéneas (Ct ≅ 32.5). El HRMA mostró una concordancia del 97.49% con la técnica de referencia, la secuenciación. El protocolo de disociación de alta resolución amplifica el ADN antes de su caracterización, por lo que esta técnica podría ser eventualmente utilizada para confirmar la presencia del ILTV y, al mismo tiempo, distinguir haplotipos, optimizando su valor como herramienta de diagnóstico. Esta característica implica una reducción significativa en el tiempo dedicado al procesamiento de muestras.EEA Concepción del UruguayFil: Rojas, Marí­a Florencia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio de Sanidad Aviar; ArgentinaFil: Konig, Guido Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Vagnozzi, Ariel Eduardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; ArgentinaFil: Vera, Federico Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio Sanidad Aviar; ArgentinaFil: Scolaro, Luis Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Craig, Marí­a Isabel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; ArgentinaElsevier2020-09-29T14:26:53Z2020-09-29T14:26:53Z2020-09info:eu-repo/semantics/articleinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_6501info:ar-repo/semantics/articuloapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/20.500.12123/7988https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S032575412030064X0325-75411851-7617https://doi.org/10.1016/j.ram.2020.04.008Revista Argentina de Microbiología (Available online 10 September 2020)reponame:INTA Digital (INTA)instname:Instituto Nacional de Tecnología Agropecuariaenginfo:eu-repo/semantics/openAccesshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0)2025-09-29T13:45:02Zoai:localhost:20.500.12123/7988instacron:INTAInstitucionalhttp://repositorio.inta.gob.ar/Organismo científico-tecnológicoNo correspondehttp://repositorio.inta.gob.ar/oai/requesttripaldi.nicolas@inta.gob.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:l2025-09-29 13:45:02.505INTA Digital (INTA) - Instituto Nacional de Tecnología Agropecuariafalse
dc.title.none.fl_str_mv Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
title Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
spellingShingle Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
Rojas, María Florencia
Enfermedades de los Animales
Laringotraqueitis
Virus Bronquitis Infecciosa Aviar
Genética
Animal Diseases
Laryngotracheitis
Avian Infectious Bronchitis Virus
Genetics
Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa Aviar
Avian Infectious Laryngotracheitis Virus
title_short Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
title_full Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
title_fullStr Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
title_full_unstemmed Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
title_sort Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
dc.creator.none.fl_str_mv Rojas, María Florencia
Konig, Guido Alberto
Vagnozzi, Ariel Eduardo
Vera, Federico Sebastian
Scolaro, Luis Alberto
Craig, María Isabel
author Rojas, María Florencia
author_facet Rojas, María Florencia
Konig, Guido Alberto
Vagnozzi, Ariel Eduardo
Vera, Federico Sebastian
Scolaro, Luis Alberto
Craig, María Isabel
author_role author
author2 Konig, Guido Alberto
Vagnozzi, Ariel Eduardo
Vera, Federico Sebastian
Scolaro, Luis Alberto
Craig, María Isabel
author2_role author
author
author
author
author
dc.subject.none.fl_str_mv Enfermedades de los Animales
Laringotraqueitis
Virus Bronquitis Infecciosa Aviar
Genética
Animal Diseases
Laryngotracheitis
Avian Infectious Bronchitis Virus
Genetics
Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa Aviar
Avian Infectious Laryngotracheitis Virus
topic Enfermedades de los Animales
Laringotraqueitis
Virus Bronquitis Infecciosa Aviar
Genética
Animal Diseases
Laryngotracheitis
Avian Infectious Bronchitis Virus
Genetics
Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa Aviar
Avian Infectious Laryngotracheitis Virus
dc.description.none.fl_txt_mv A previous sequence analysis of a US5 gene fragment of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) performed in an Argentinian epidemiological study allowed to differentiate between wild and vaccine strains. This analysis also defined five ILTV haplotypes with specific variations at positions 461, 484, 832, 878 and 894 of the US5 gene. This characterization of viral strains may also be accomplished using the High-Resolution Melting Analysis (HRMA), which has been described as an effective, fast and sensitive method to detect mutations in PCR products. In the present study, an HRM protocol was developed with the aim of characterizing the circulating ILTV strains in Argentina. The specificity of this tool was confirmed in different DNA diluents, without interference from heterologous DNA or other cellular metabolites. Additionally, the salt concentration in the elution buffer used for DNA extraction did not alter the curve profiles. Higher concentrations of DNA (Ct ≅ 26.0) displayed well-defined curve profiles, whereas lower concentrations (Ct ≅ 32.5) exhibited more heterogeneous curves. The HRMA showed 97.49% concordance with the reference technique, i.e., sequencing. The HRM protocol has the capability to perform DNA amplification prior to its characterization. Thus, eventually this technique may be used simultaneously as a diagnostic tool. This advantage implies a significant reduction in the time and effort involved in sample processing.
En un estudio epidemiológico realizado previamente en Argentina, se analizó la secuencia de un fragmento del gen US5 del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), lo que permitió diferenciar las cepas de campo de las vacunales. También esto permitió definir cinco haplotipos del ILTV, con variaciones específicas en las posiciones 461, 484, 832, 878 y 894 del gen US5. La caracterización de las cepas virales también puede lograrse mediante el análisis de la disociación de alta resolución o high-resolution melting analysis (HRMA), descripto como un método efectivo, rápido y sensible para detectar mutaciones en productos de PCR. En el presente estudio se desarrolló un protocolo de disociación de alta resolución con el objetivo de caracterizar cepas del ILTV circulantes en Argentina. Para ello,se confirmó la especificidad de esta herramienta en diferentes diluyentes del ADN de las muestras, sin observarse interferencias en presencia de ADN heterólogo u otros metabolitos celulares. Asimismo, la concentración de sales en el buffer de elución utilizado durante la extracción de ADN no alteró los perfiles de las curvas. Se obtuvieron perfiles bien definidos con concentraciones de ADN más elevadas (Ct ≅ 26.0), mientras que concentraciones más bajas presentaron curvas heterogéneas (Ct ≅ 32.5). El HRMA mostró una concordancia del 97.49% con la técnica de referencia, la secuenciación. El protocolo de disociación de alta resolución amplifica el ADN antes de su caracterización, por lo que esta técnica podría ser eventualmente utilizada para confirmar la presencia del ILTV y, al mismo tiempo, distinguir haplotipos, optimizando su valor como herramienta de diagnóstico. Esta característica implica una reducción significativa en el tiempo dedicado al procesamiento de muestras.
EEA Concepción del Uruguay
Fil: Rojas, Marí­a Florencia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio de Sanidad Aviar; Argentina
Fil: Konig, Guido Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina
Fil: Vagnozzi, Ariel Eduardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina
Fil: Vera, Federico Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio Sanidad Aviar; Argentina
Fil: Scolaro, Luis Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina
Fil: Craig, Marí­a Isabel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina
description A previous sequence analysis of a US5 gene fragment of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) performed in an Argentinian epidemiological study allowed to differentiate between wild and vaccine strains. This analysis also defined five ILTV haplotypes with specific variations at positions 461, 484, 832, 878 and 894 of the US5 gene. This characterization of viral strains may also be accomplished using the High-Resolution Melting Analysis (HRMA), which has been described as an effective, fast and sensitive method to detect mutations in PCR products. In the present study, an HRM protocol was developed with the aim of characterizing the circulating ILTV strains in Argentina. The specificity of this tool was confirmed in different DNA diluents, without interference from heterologous DNA or other cellular metabolites. Additionally, the salt concentration in the elution buffer used for DNA extraction did not alter the curve profiles. Higher concentrations of DNA (Ct ≅ 26.0) displayed well-defined curve profiles, whereas lower concentrations (Ct ≅ 32.5) exhibited more heterogeneous curves. The HRMA showed 97.49% concordance with the reference technique, i.e., sequencing. The HRM protocol has the capability to perform DNA amplification prior to its characterization. Thus, eventually this technique may be used simultaneously as a diagnostic tool. This advantage implies a significant reduction in the time and effort involved in sample processing.
publishDate 2020
dc.date.none.fl_str_mv 2020-09-29T14:26:53Z
2020-09-29T14:26:53Z
2020-09
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/article
info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
http://purl.org/coar/resource_type/c_6501
info:ar-repo/semantics/articulo
format article
status_str acceptedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv http://hdl.handle.net/20.500.12123/7988
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S032575412030064X
0325-7541
1851-7617
https://doi.org/10.1016/j.ram.2020.04.008
url http://hdl.handle.net/20.500.12123/7988
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S032575412030064X
https://doi.org/10.1016/j.ram.2020.04.008
identifier_str_mv 0325-7541
1851-7617
dc.language.none.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0)
eu_rights_str_mv openAccess
rights_invalid_str_mv http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0)
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Elsevier
publisher.none.fl_str_mv Elsevier
dc.source.none.fl_str_mv Revista Argentina de Microbiología (Available online 10 September 2020)
reponame:INTA Digital (INTA)
instname:Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
reponame_str INTA Digital (INTA)
collection INTA Digital (INTA)
instname_str Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
repository.name.fl_str_mv INTA Digital (INTA) - Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
repository.mail.fl_str_mv tripaldi.nicolas@inta.gob.ar
_version_ 1844619147558780928
score 12.559606