Estrategia diagnóstica de paratuberculosis en bovinos

• Autores: Gilardoni, Liliana Rosa
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Paolicci, Fernando; Mundo, Silvia Leonor
• Materia: Bovinos; Paratuberculosis; Diagnóstico; Microbiología
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Paratuberculosis (PTB) is a chronic disease of ruminants, characterized by a long incubation period and development of granulomatous enteritis and diarrhea in advanced stages of the disease. It is caused by Mycobacterium avium\nsubspecies paratuberculosis (Map). Its economic relevance is due to reduced\nmilk yield, progressive cachexia and mortality.\nDepending on the severity of clinical signs, the evolution of bovine PTB can be\ndivided into four stages: silent, subclinical, clinical, and advanced. The animals\nin the early stages, which are usually the longest, excrete Map by colostrum,\nmilk and feces, with no evidence of clinical signs. In this way, the spread of the\ninfection to other susceptible animals, particularly calves, takes place. For these reasons, control of the disease should be based on early detection\nand rapid culling of infected animals. However, currently available diagnostic\ntests have not enough sensitivity to do feasible the implementation of this type\nof strategy. The recognized and currently in use diagnostic tests for the diagnosis of PTB\nare fecal culture and indirect ELISA test for the detection of serum antibodies. In\nsubclinical stages the sensitivity of these tests is below 50%. In order to improve the diagnostic sensitivity, biotechnology was applied for the\ndevelopment of new methods, as the polymerase chain reaction (PCR) that can be applied in feces, milk and tissues samples.\nHowever, the elimination of Map by feces or milk is intermittent and with a low\nconcentration. Therefore to increase sensitivity a method of concentration of\nMap was developed: immunomagnetic separation (IMS) using magnetic\nnanoparticles coupled to polyclonal antibodies antiMap. The procedure applied to bovine milk not only increases the concentration of Map, but also removes\nthe milk components PCR inhibitors. The purpose of this thesis was to develop a procedure to identify Map in milk samples. The developed protocol has two stages: a. concentration of microorganisms by immunomagnetic separation with magnetic nanoparticles (immunomagnetic beads) coupled to specific\nmonoclonal and polyclonal antibodies produced in the Faculty of Veterinary Science, University of Buenos Aires.\nb. identification of genetic material by the application of IS900 PCR with\nprimers designed in the same Faculty.\nIn addition, in order to evaluate the performance of the method in field\nconditions (preliminary assessment), samples from dairy cows from both\ninfected and free farms were analyzed. The maximum adhesion of immunomagnetic beads was obtained when beads\ncoupled to monoclonal antibodies were used simultaneously with beads\ncoupled to polyclonal antibodies (107 CFU/mL).\nA greater analytical sensitivity was obtained with the IS900 PCR with primers\ndesigned by Dr. S. L, Mundo, at the Faculty of Veterinary Science, compared to\nthe IS900 PCR with primers designed by Dr. Collins et al. and ISF57 PCR (the\nmethods were able to detect 101, 103 and 102 Map CFU/mL respectively).\nFurthermore, the IS900 PCR did not present cross-reaction when they were\ntested with other mycobacteria like M. avium subsp. avium, M. phlei, M.\nfortuitum and M. scrofulaceum.\nIn field conditions, was used the milk, feces and blood samples of 147\nasymptomatic dairy cows from 5 infected farms and 118 of cows with same\ncondition from 4 free-farms. These samples were analyzed by the method\ndeveloped (IMS-PCR IS900), by milk and fecal culture MF and by indirect\nELISA in serum.\nFrom the infected farms samples were obtained following positive results: IMSIS900 PCR: 80 (54.4%), milk culture: 2 (1.4%), fecal culture: 17 (11.6 %) and\nELISA: 52 (35.4%). The 118 samples from the 4 free-farms were negative to all\ntests. The agreement between IMS-IS900 PCR and fecal culture and between IMSIS900\nPCR and ELISA showed a low level. This is consistent with the low sensitivity that those methods present in the asymptomatic cows. The sensitivity and specificity for the fecal culture with respect to IMS-IS900 PCR were\nestimated at 18.8% and 98.9% respectively. For ELISA, these parameters were estimated at 36.2% and 87.6% respectively.\nThe absence of positive results in the free farms is an indicator of the high level\nof specificity shown by the IMS-IS900 PCR.\nThe results obtained in this work suggest that IMS-IS900 PCR technique has a\ndiscriminatory capacity more efficiently than currently available tests.\nFurthermore, this technique in comparison with the fecal or milk culture has the\nadvantage in processing time, which is significantly lower than that required for\nculture. The above justifies the method is validated and subsequently deployed for use as routine diagnosis of field samples.
Fil: Gilardoni, Liliana Rosa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
La paratuberculosis (PTBC) es una enfermedad crónica de los rumiantes, caracterizada por presentar un largo período de incubación y producir enteritis granulomatosa y diarrea profusa en estadios avanzados. Es causada por\nMycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map). Su importancia\neconómica se debe a las pérdidas asociadas con el descenso de la producción\nláctea, el desmejoramiento de los animales y la mortalidad. Según la severidad de los signos clínicos, la evolución de la PTBC bovina puede dividirse en cuatro estadios: silencioso, subclínico, clínico y avanzado. Los animales que cursan los primeros estadios, que habitualmente son los de mayor duración, excretan Map por calostro, leche y heces sin evidenciar signos clínicos. De esta manera transmiten la infección a otros animales susceptibles, particularmente a los terneros. Por lo expuesto, el control de la enfermedad debería basarse en la detección precoz y eliminación temprana de los animales infectados. Sin embargo, las pruebas diagnósticas disponibles actualmente adolecen de una marcada falta\nde sensibilidad, que las hace incompatibles con este tipo de estrategia. Las pruebas reconocidas y corrientemente en uso para el diagnóstico de PTBC\nson el cultivo de materia fecal y la prueba de ELISA indirecto para la detección\nde anticuerpos séricos. En estadios subclínicos la sensibilidad de estas\npruebas se encuentra por debajo del 50%. A fin de mejorar la sensibilidad diagnóstica se desarrollaron técnicas de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que puede ser aplicada en muestras de materia fecal, leche y tejidos.\nSin embargo, la eliminación de Map por las dos primeras vías es intermitente y\ncon una baja concentración. Por consiguiente, para incrementar la sensibilidad\nse desarrolló un método de concentración de microorganismos: la separacióni\ninmunomagnética (IMS) mediante la utilización de nanopartículas imantadas\nacopladas a anticuerpos policlonales antiMap. El procedimiento aplicado a la\nleche bovina no solo aumenta la concentración de Map, sino que además\nelimina los componentes lácteos inhibidores de la PCR. La finalidad de esta tesis fue desarrollar un procedimiento de identificación de\nMap en muestras de leche. El protocolo elaborado cuenta con dos etapas:\na. concentración del microorganismo por separación inmunomagnética con\nnanopartículas imantadas (perlas inmunomagnéticas) acopladas a anticuerpos monoclonales y policlonales específicos, producidos en la\nFacultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires.\nb. identificación del material genético mediante la aplicación de una PCR\nIS900 con cebadores diseñados en la misma casa.\nAdemás, a fin de evaluar la técnica en condiciones de campo (evaluación\npreliminar), se analizaron muestras de leche cruda de bovinos procedentes de\nestablecimientos infectados y libres de PTBC.\nLa máxima capacidad de adhesión de las perlas inmunomagnéticas se obtuvo cuando se utilizaron de manera simultánea perlas acopladas a anticuerpos monoclonales y perlas acopladas a anticuerpos policlonales (107 UFC/mL). La PCR IS900 con los cebadores diseñados por la Dra. S. L. Mundo, en la Facultad de Ciencias Veterinarias mostró mayor sensibilidad analítica que con los cebadores diseñados por el Dr. Collins y col. y que la PCR ISF57,\ndetectando 101, 103 y 102 UFC de Map/mL, respectivamente. Además, no presentó reacción cruzada cuando fueron enfrentadas con otras micobacterias como M. avium subsp. avium, M. phlei, M. fortuitum ni con M. scrofulaceum. En el ensayo a campo, se tomaron muestras de leche, materia fecal (MF) y sangre de 147 animales asintomáticos provenientes de 5 establecimientos\ninfectados, y de 118 animales de 4 establecimientos libres de PTBC. Dichas muestras fueron analizadas por el método desarrollado (IMS-PCR IS900), por\ncultivo de leche y de MF y por ELISA indirecto en suero. De las muestras provenientes de los establecimientos infectados se obtuvieron los siguientes resultados positivos: IMS-PCR IS900: 80 (54,4%), cultivo de leche: 2 (1,4%), cultivo de MF: 17 (11,6%) y ELISA: 52 (35,4%). Las 118\nmuestras de los establecimientos libres resultaron negativas a todas las pruebas.La concordancia entre IMS-PCR IS900 y el cultivo de MF, y entre IMS-PCR IS900 y el ELISA presentó un nivel leve. Esto es consistente con la baja\nsensibilidad que tanto el cultivo como el ELISA presentan en animales\nasintomáticos. La sensibilidad y la especificidad relativas del cultivo de materia\nfecal con respecto a IMS-PCR IS900 fueron estimadas en 18,8% y 98,9% respectivamente. Para el ELISA, estos parámetros fueron estimados en 36,2%\ny 87,6% respectivamente.\nLa ausencia de resultados positivos en los establecimientos libres es un\nindicador del alto nivel de especificidad demostrado por la IMS-PCR IS900.\nLos resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la técnica de IMS-PCR\nIS900 tiene una capacidad de discriminación más eficiente que las pruebas\nactualmente disponibles. Además, frente al cultivo de MF o de leche presenta\nla ventaja en el tiempo de procesamiento, que es significativamente más\nreducido que el necesario para un cultivo. Lo mencionado justifica que el método sea validado y posteriormente\nimplementado para su uso como diagnóstico rutinario de muestras de campo.
Microbiología
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias