Características cito-moleculares de la translocación t(9;22) y análisis del reordenamiento BCR/ABL1 en pacientes con Leucemia Mieloide Crónica

• Autores: Gutiérrez, Leandro Germán
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: De Brasi, Carlos Daniel; Lazarowski, Alberto; Larripa, Irene Beatriz; Rivolta, Carina; Rossetti, María victoria; Giere, Isabel
• Materia: LMC; t(9;22); Cromosoma Ph
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Gutiérrez, Leandro Germán. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La Leucemia Mieloide Crónica (LMC) es una enfermedad clonal de células madre hematopoyéticas (CMHs) de médula ósea (MO). La alteración citogenética característica es el cromosoma Philadelphia (Ph), producto de una translocación recíproca entre los brazos largos de los cromosomas 9 y 22 [t(9;22)(q34;q11)]. La consecuencia molecular de esta translocación es el gen quimérico BCR/ABL1 con actividad Tirosina Kinasa (TK) no regulada. Un 10?20% de los casos de LMC presentan deleciones adyacentes a los puntos de ruptura de la t(9;22) sobre el cromosoma der(9). Estas deleciones tienen un tamaño variable que frecuentemente afecta tanto secuencias del cromosoma 9 como del cromosoma 22 y su valor pronóstico en la era de los inhibidores de TK (ITKs) es controversial.\nCon el objetivo de estudiar las deleciones submicroscópicas sobre 9q34 en pacientes con LMC (n=61) y desarrollar una herramienta molecular de caracterización del rearreglo BCR/ABL1 genómico este trabajo incluye metodologías citogenéticas, cito-moleculares (FISH), de evaluación de niveles de expresión transcripcional y de análisis genómico de los rearreglos BCR/ABL1 y el recíproco ABL1/BCR (PCR Inversa, PCR de larga distancia, PCR convencional y secuenciación de Sanger).\nLa frecuencia de deleciones sobre el der(9) encontrada en nuestro análisis alcanzó un 23% (14/61) del total de casos con LMC. Estos pacientes no presentaron diferencias significativas en sus características epidemiológicas y clínicas respecto a pacientes sin deleciones. Ocho de los 14 casos (57%) presentaron deleciones completas, afectando secuencias tanto de ABL1 como de BCR. Tres pacientes (21%) tuvieron deleciones que sólo afectaron secuencias de BCR y otros tres (21%) presentaron coexistencia de dos clones neoplásicos con diferentes patrones de deleción, demostrando que al menos en algunos casos, las deleciones sobre el der(9) no son un evento simultáneo a la t(9;22).\nNuestro análisis, en concordancia con otros reportes, no mostró evidencia que sugiera que las deleciones sobre el der(9) promuevan inestabilidad cromosómica o que afecten los niveles de expresión de BCR/ABL1.\nPara llevar adelante el análisis de haplo-insuficiencia, realizamos la evaluación de los niveles de expresión de tres genes supresores de tumor (GST) (ASS1, PTGES y SMARCB1) cercanos al punto de ruptura en el der(9). De los tres genes analizados, sólo la expresión relativa de ASS1 fue afectada significativamente por la presencia de deleciones (n=14) respecto de los casos sin deleciones (n=47) (mediana de expresión relativa, 0,07 vs 0,45, p=0,0001). Este dato constituye evidencia a favor de la hipótesis que sostiene que las deleciones sobre el der(9) afectan GSTs por el mecanismo de haploinsuficiencia.\nPara evaluar si las deleciones tienen algún efecto pronóstico, comparamos los niveles de respuesta hematológica completa (RHC), citogenética mayor (RCgMa) y molecular ?3 log (RM3.0) alcanzados a los seis y 12 meses de iniciado el tratamiento con ITKs, en pacientes con y sin deleciones, no hallando diferencias significativas entre ambos grupos. Sin embargo, los valores de odd ratio (OR) mostraron cierta tendencia en los primeros seis meses de tratamiento (3,6 para RHC, de 2,6 para RCgMa, y de 4,5 RM >3 log) que disminuyó a los 12 meses (OR: RHC: 1,6; RCgMa: 1,5 y RM >3 log: 1,8), indicando que la presencia de deleciones en el der(9) podría constituir una señal de alerta (warning) a tener en cuenta en la respuesta a tratamiento con ITKs.\nEl tamaño acotado del cluster de ruptura de BCR (3,3 Kb) nos permitió el diseño, desarrollo y aplicación de un abordaje basado en PCR inversa para la caracterización del reordenamiento BCR/ABL1 y su recíproco en seis pacientes con LMC al diagnóstico. Este abordaje permitió la elaboración de reacciones PCR directas de alta sensibilidad paciente-específica (PCR-PE) de gran utilidad para detectar la presencia de enfermedad mínima residual con potencial para la identificación de candidatos a iniciar protocolos de interrupción de tratamiento. La PCR-PE pudo detectar la presencia del clon neoplásico en todos los controles del tratamiento de los pacientes evaluados en paralelo por qRT-PCR mostrando una perfecta correlación entre ambas técnicas. Las características genómicas encontradas sobre los puntos de ruptura en BCR y en ABL1 (elementos Alu, motivos recombinogénicos, cicatrices moleculares) nos permitieron sugerir al menos dos mecanismos moleculares diferentes implicados en el origen de la translocación t(9;22): NHEJ (Non Homologous End Joining) en 4 casos y FoSTeS (Fork Stalling and Template Switching) en los dos casos restantes.\nEl abordaje de caracterización del rearreglo genómico BCR/ABL1, constituye una mejora significativa en la costo-efectividad y rapidez para la obtención de PCR-PE, cualidad que la convierten en una metodología ideal para el análisis de la translocación t(9;22) por PCR para su integración al sistema de salud aun en países con recursos limitados.\nEl conjunto de datos presentados en esta tesis indican que la LMC es una patología compleja, heterogénea desde su origen, y asociada a múltiples características que hacen de cada paciente un caso único cuya descripción completa requiere de la combinación de abordajes citogenéticos, cito-moleculares y moleculares sobre muestras de ARN y ADN genómico.
Ciencias de la salud
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Farmacia y Bioquímica